温阳解毒化瘀颗粒对肝衰竭内毒素血症大鼠肠道sIgA的影响*

王 轩 陈 斌 彭 杰 苏煦初 孙克伟 李 武 周 为

湖南中医药大学第一附属医国家中医 (肝病)临床研究基地、湖南省中医药管理局重型肝炎证治研究室、国家中医药管理局中医肝胆病重点学科 (湖南长沙，410007)

近年来胃肠屏障功能在肝衰竭发病机制中越来越被重视，研究发现其与肝衰竭的发生发展有密切关系［1，2］，对内毒素血症形成亦有重要影响。内毒素血症是影响肝衰竭一个重要因素，减轻内毒素血症可改善肝衰竭患者的病情。有研究发现温阳解毒化瘀颗粒可减轻内毒素血症，从而起到抗肝衰竭效应［3］。本实验从肠道免疫屏障方面，进一步研究温阳解毒化瘀颗粒减轻内毒素血症的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠60只，体重130～150g，由湖南中医药大学医学实验动物中心提供。动物合格证号:SCXK(湘)2009-0004。

1.2 药物与试剂 温阳解毒化瘀颗粒由茵陈、白术、丹参、苡米各30g，附片10g，赤芍60g组成，药物均采用中药浓缩颗粒剂 (华润三九医药股份有限公司，批号分别为:1108001S、 1108002S、 1110001S、 1109002S、 1109002S、1108001S)。D-半乳糖胺 (南通通吕生物制品有限公司，批号:20111106)使用时配成20%溶液，并用1M的NaOH调pH至7.0。终点基质鲎试剂盒 (厦门市鲎试剂实验厂有限公司，批号:110620)。大鼠sIgA ELISA试剂盒 (美国RD公司，批号:201110)

1.3 仪器 UV-1800型紫外分光光度计 (日本岛津公司)，HHW21420S型电热恒温水温箱 (上海跃进医疗器械厂)，AY120型电子天平 (日本岛津公司)。Thermo Scientific MK3型酶标仪 (Thermo Fisher公司)

1.4 模型建立、分组与给药 60只SD大鼠随机分为正常组(10只)、模型组 (25只)和实验组 (25只)。造模法参照文献［4，5］，并加以改进，模型组、实验组大鼠分别称重后给予D-半乳糖胺2.0g/kg一次性腹腔注射，24小时后成模;正常组大鼠给予等剂量生理盐水腹腔注射。每公斤体重给药量:按照人与大鼠体表面积关系换算大鼠的日用量:中药生药29.98g，使用时，用蒸馏水将中药颗粒配成浓度为0.169g/ml的溶液，将乳果糖配成体积分数为20%的溶液，将双歧三联活菌配成浓度为0.0084g/ml的溶液;实验组大鼠给予温阳解毒化瘀方颗粒剂;正常组与模型组大鼠给予等剂量生理盐水。灌胃量20ml·kg－1·d－1，于造模前4天开始灌胃给药，2次/d，直至动物处死。

1.5 观察指标 ①内毒素检测:抽取门静脉血1ml装入无热原抗凝管，3000 rpm，离心1分钟，取上清血浆标本，行内毒素检测，具体方法参照终点基质鲎试剂盒说明书。②观察肝组织病理学改变:取右叶肝组织，生理盐水洗净血液，10%甲醛固定，常规石蜡包埋，4μm切片，逐级脱蜡，HE染色，光镜下观察肝脏的病理学改变。③肠道sIgA含量检测:取靠近回盲部小肠10cm，纵向剖开，无菌生理盐水冲洗肠内容物，轻刮肠黏膜表面黏液于EP管中，再加入0.01mol/L PBS 1ml，充分混匀，3000转/分，离心15分钟取上清液，以ELISA法检测肠道sIgA，并以双缩脲法测定黏液蛋白含量，以计算每毫克黏液蛋白中肠道sIgA的含量。

2 结果

2.1 各组大鼠肝门静脉内毒素检测结果 与正常组相比，模型组大鼠12小时门静脉内毒素水平稍开始升高，至24小时明显升高，与正常组比较，差异有显著性意义 (F=8.52，P＜0.01);实验组大鼠门静脉内毒素水平较模型组均降低，12小时与模型组比较，差异无显著性意义，24小时与模型组比较，差异有显著性意义 (F=3.97，P＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠门静脉内毒素水平比较 (±s，EU/ml)

表1 各组大鼠门静脉内毒素水平比较 (±s，EU/ml)

与正常组同时段比较，△P＜0.05;与模型组24h比较，*P＜0.05

组别 n 内毒素12h 24h正常组10 0.317±0.239 0.317±0.239模型组 10 0.460±0.317 0.921±0.426△实验组 10 0.450±0.272 0.603±0.349*

2.2 各组大鼠肝组织病理学结果 按损伤范围不同给予积分;“－”为组织结构正常，0分;“+”为可见肝细胞点状坏死，1分;“++”为肝细胞坏死范围＜1/3肝小叶，2分;“+++”为肝细胞坏死范围占肝小叶1/3～2/3，3分;“++++”为肝细胞坏死范围＞2/3肝小叶，4分。

与正常组相比，模型组大鼠12小时肝脏病理改变明显加重，差异有显著性意义 (Z=－4.119，P＜0.05);24小时改变更明显 (Z=－4.091，P＜0.01)。实验组大鼠肝组织病理改变程度较模型组轻，12小时与模型组比较差异无显著性意义;24小时时肝病理改变程度较模型组减轻 (Z=－2.804，P＜0.05)，差异有显著性意义。见表2。

2.3 各组大鼠肠道sIgA检测结果 与正常组相比，模型组12小时肠道sIgA明显下降，差异有统计学意义 (F=5.02，P＜0.05);之后出现回升。实验组也表现出一样的变化趋势，12小时与模型组比较，差异无显著性意义;24小时时肠道sI-gA水平较模型组明显升高 (F=5.34，P＜0.05)。见表3。

表2 各组大鼠肝组织病理评分比较 (分)

表3 各组大鼠肠道sIgA检测结果比较(±s，μg/mg)

表3 各组大鼠肠道sIgA检测结果比较(±s，μg/mg)

与正常组同时段比较，△P＜0.05;与模型组24小时比较，*P＜0.05

sIgA 12h 24h正常组组别 n 10 2.624±1.177 2.624±1.177模型组 10 1.575±0.597△ 2.226±0.722实验组 10 1.637±0.588 3.815±1.045△＊

3 讨论

内毒素是革兰阴性细菌细胞壁外层成分，其对人体的毒性成份是脂多糖 (LPS)。肠道是机体最大的细菌和内毒素贮库。肝衰竭时患者肠道菌群发生紊乱，肠道各正常菌群之间的平衡遭到破坏，专性厌氧菌显著减少，革兰阴性杆菌显著增多，当这些细菌死亡时，可释放大量内毒素，从而导致内毒素的来源大量增加。同时因门静脉高压，肠黏膜瘀血、水肿、糜烂、肠黏膜及血管通透性增加，肠黏膜屏障功能减弱，大量内毒素经肠黏膜下微血管入血，加之肝脏受损严重，肝枯否细胞功能紊乱，内毒素得不到有效清除，形成ITEM。

肠道免疫屏障由肠黏膜上皮细胞分泌的sIgA等抗体以及黏膜下淋巴组织共同组成，参与机体免疫监控和免疫防御，对阻止内毒素的吸收有重要的作用。固有层淋巴细胞分泌的IgA和IgM可调节肠上皮细胞的凋亡，对肠道菌群也起到重要的调节作用，且固有层淋巴细胞中浆细胞分泌的sIgA也对肠道的免疫功能起到了重要的保护作用。肝衰竭时机体免疫功能下降，肠黏膜上皮细胞sIgA分泌减少［6，7］，从而增加了细菌的黏附的机会，进而使细菌及内毒素移位更易发生。说明肠黏膜IgA水平高低与肠黏膜免疫屏障损伤密切相关［8］。

温阳解毒化瘀颗粒经前期临床应用，证实其降低肝衰竭患者病死率和促进黄疸消退等疗效良好［9，10］。该方由茵陈、白术、附片、丹参、赤芍、苡米组成，赤芍具有清热解毒、活血化瘀的功能，方中重用赤芍以加强解毒化瘀的功效，附片大辛大热有温补脾肾的功效，并可防方中药物寒凉太过，两者寒热并用为君药;配伍茵陈、丹参为臣药，以配合君药加强清热化湿，活血化瘀的功效;再佐以白术、苡米以燥湿健脾益气，防诸药损伤脾胃。现代研究表明茵陈、白术、附子、苡米均有抗炎、增强免疫的作用。

本实验证实温阳解毒化瘀颗粒能增加肠道sIgA的分泌，提示该方有增强肠道免疫屏障的作用，同时发现模型组大鼠的肠道sIgA分泌量在肝损伤初期显著减少，24小时时开始有所恢复，说明肝衰竭初期肠道免疫屏障受损严重，而实验组大鼠肠道sIgA分泌量则多于模型组，说明该方减轻内毒素血症的机制与该方增加肠道sIgA分泌，减少内毒素的吸收有密切关系，提示增加肠道sIgA分泌是温阳解毒化瘀颗粒改善ITEM的机制之一。另外，模型组大鼠24小时肠道sIgA有所升高，但内毒素水平反而没有下降，提示肝衰竭肠道IETM的调节机制较为复杂，如肝枯否细胞的参与等［11］，可以作为该方的作用靶点之一进行进一步研究。

［1］杨洁，聂青和.肝衰竭与肠道屏障功能障碍 ［J］.实用肝脏病杂志，2010，13(1):66－69.

［2］邓芝云，单体栋，张方信，等.重症肝炎与肠黏膜屏障 ［J］.世界华人消化杂志，2010，18(35):3761－3766.

［3］陈斌，王轩，李武，等.温阳解毒化瘀方对肝衰竭大鼠内毒素血症的影响［J］.中西医结合肝病杂志，2012，22(4):231－233.

［4］ ZHANG L，KANG W，LEIY，et al.Granulocyte colony－stimulating factor treatment ameliorates liver injury and improves survival in rats with D－galactosamine-induced acute liver failure［J］.Toxicology letters，2011，204(1):92 －99.

［5］ HOCHER B，HEIDEN S，VON WEBSKY K，et al.Dual endothelinconverting enzyme/neutral endopeptidase blockade in rats with D-galactosamine-induced liver failure［J］ .European journal of medical research，2011，16(6):275－279.

［6］刘冬妍，丁鹏，刘沛，等.急性肝坏死动物模型肠道sIgA的变化 ［J］.中国医科大学学报，2010，39(8):613－615.

［7］刘冬妍，鲁学恒，刘沛，等.重症肝炎患者肠道屏障功能的变化［J］.中国综合临床，2008，24:412－414.

［8］ FU JL，WNAG ZH，LI GZ，et al.Decreased IgA+plasma cells and IgA expression in acute liver necrosis mice［J］ .World J Gastroenterol，2010，16:3827 －3833.

［9］孙克伟，陈斌，黄裕红，等.凉血解毒、清热化湿和凉血解毒、健脾温阳法治疗慢性重型肝炎的临床观察 ［J］.中国中西医结合杂志，2006，26(11):981－983.

［10］陈斌，黄裕红，龚磊，等.健脾温阳与清热化湿法治疗血浆置换术后慢性重型肝炎的临床比较 ［J］.中西医结合肝病杂志，2008，18(6):368－370.

［11］ NOLAN JP.The role of intestinal endotoxin in liver injury:a long and evolving history［J］.Hepatology，2010，52(5):1829－1835.