超衍射成像中双螺旋点扩展函数的三维定位精度*

陈鹤 于斌 陈丹妮 李恒 牛憨笨

(深圳大学光电工程学院,光电子器件与系统(教育部/广东省)重点实验室,深圳 518060)

(2013年3月7日收到;2013年3月29日收到修改稿)

1 引言

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近较是年大基来的于,发缩远展小场有[1纳].效米目激分前发辨最光荧为斑突光,出显 通的微 过方成 直法像 接有技 减两术 小种取点,扩展函数的半高宽来提高分辨率,包括受激辐射耗尽(stimulated emission depletion,STED)、基态耗尽(ground state depletion,GSD)、饱和结构激发显微术(saturated pattern excitation microscopy,SPEM)等;另一种则是基于单分子定位技术,包括随机光学重建显微术(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM)、光敏定位显微术(photoactivated localization microscopy,PALM)及荧光PALM(fl uorescence photoactivation localization microscopy,fPALM)等.前者是利用受激态或基态耗尽的方式,压缩荧光有效发射区域;后者则是利用荧光标记本身的开关效应,通过稀疏激发、分时成像、质心定位以及图像合成来实现纳米分辨成像,并已经实现20 nm的横向空间分辨率成像.

然而,传统的单分子定位方法只能对分子进行二维也就是横向定位,但对于轴向分辨率并没有提高.结合某些改进轴向分辨率的方法,如柱面镜定位[2]、双焦面探测[3]、双螺旋点扩展函数法(double helix point spread function,DH-PSF)[4]以及荧光干涉法[5]等,能将轴向分辨率提高到50 nm的水平.其中,DH-PSF是通过特殊设计相位板,改变系统的点扩展函数形成双螺旋的形式,并且旋转的方向与荧光分子的轴向位置有关,从而获得荧光分子的轴向定位.该方法具有相比其他方法更长的可探测焦深范围,并且在整个成像深度内,点扩展函数的形状近似不变,仅随轴向位置发生旋转,而不像其他方法需要通过精确形状图像比对来得到轴向位置,从而定位精度可以做得更高.

考虑到单分子定位超分辨方法中,定位精度直接决定了其极限分辨率,因此有必要对DH-PSF的三维定位精度进行详细的分析.本文通过两种方法来分析DH-PSF的三维定位精度：首先,基于费希尔信息量(Fisher information,FI)理论分析了DH-PSF的三维FI理论定位精度;此外,基于高斯拟合质心定位算法,利用误差传递理论求得DH-PSF的三维模拟质心定位精度,并对二者进行了比较和分析.结果表明,在光子数大于1000的情况下,二者得到的定位精度接近.本文重点分析了光子数、背景噪声、轴向位置对定位精度的影响,这将对于DH-PSF的三维定位实验提供理论指导.

2 DH-PSF实现三维纳米定位原理

DH-PSF实现三维纳米定位是基于一种被称为自成像的现象.DH-PSF是一种三维光学响应,具有随离焦量不断旋转的圆形不对称横截面轮廓.实现DH-PSF的主要方法是通过位于Laguerre-Gauss(LG)模式平面上特定直线上的LG模式的线性叠加.LG光束模式的线性叠加构成自成像光束.LG光束模式为[6]

式中r=(ρ,φ,z)为空间点的柱坐标,ρˆ=ρ/ω(zˆ)是高斯光斑的经向坐标,为束腰半径,zˆ=z/z0纵向坐标,z0=πω02/λ为瑞利长度,un,m(r)的组成为

将(1,1),(3,5),(5,9),(7,13),(9,17)五个LG模式进行等权重叠加,形成一个新的光场分布函数,即双螺旋旋转光束(图1(a)).基于LG函数的傅里叶变换不变特性,该函数如作为光学传递函数应用到光学成像系统中,光学系统的点扩展函数将变为DH-PSF,且随离焦量变化而旋转的速度与LG模式平面上所选取的直线斜率成正比,在聚焦区速度最大(图1(c)).一个DH-PSF系统是在标准成像系统的傅里叶平面加入一个特殊设计的相位板,此相位板是其透射率函数在傅里叶变化的聚焦区形成双螺旋的形式.更特别的是它展示了两个围绕着光轴旋转的旁瓣,其中一个绕着光轴顺时针旋转,而另一个则是逆时针旋转.用DH-PSF进行三维纳米定位时,分子的横向定位点通过两个旁瓣的中点来估计,而其轴向位置则根据两个旁瓣中心连线的旋转角度(图1(b))确定[7].

3 基于FI理论计算DH-PSF的三维定位精度

FI是一种测量随机变量X与取决于X概率的未知参数θ的信息量.X的概率函数也就是θ的似然函数,记作 f(X,θ).似然函数的对数对θ的偏导数叫作得分函数.在特定的条件下,得分函数的一阶矩为0,二阶矩为FI,则FI表达式为

图1 DH-PSF (a)DH-PSF的强度与相位分布;(b)DH-PSF两个旁瓣的旋转角度与Z轴位置的关系曲线图举例;(c)DH-PSF在不同轴向位置处的图形

就基于DH-PSF的单分子定位而言,似然函数就是DH-PSF,感兴趣的参量就是单分子的横向和轴向位置根据Cramer-Rao不等式,一个未知参数θ的无偏估计值θˆ的变化往往大于或者等于FI逆矩阵[8].

DH-PSF的Cramer-Rao边界(Cramer-Rao bound,CRB)代表了无偏估计值的最小可能位置的估计方差,通过选择适当的噪声分布,可计算不同信噪比下的CRB.对于单分子的3D定位问题,3D定位精度的极限为FI逆矩阵的对角线元素的平方根,其计算如下[9]：

其中θ=(x0,y0,z0),µθ为PSF在每个像素点上的概率密度函数,β为每个像素点上的泊松背景噪声,K为总的像素数.

则其光子受限系统中的CRB为

由前面可知3D的定位精度与CRB的平方根是一致的,所以光子受限系统中的三维定位精度表达式如下：

为了计算DH-PSF的FI矩阵,我们必须求解成像函数的PSF及其偏导数.在基于双螺旋点扩展函数的荧光显微系统中,位于点(0,0,z)处的荧光分子所成的像,即为系统的DH-PSF,其3D-PSF数学模型如下[10,11]：

把qz(x,y)代入(9)—(12)式得：

i,j=1,2,3;θ∈{x,y,z},N表示总光子数,B为背景噪声.

为了计算DH-PSF的理论定位精度,我们重点分析了光子数、背景噪声、轴向位置对其定位精度的影响.所有的理论定位精度的模拟计算均在Matlab编程环境下实现.模拟参数如下：荧光波长λ=670 nm,物镜放大倍率M=100,数值孔径N=1.4,探测器像元大小为16µm.通过探测光子数的不同,可以分别求出其不同的三维定位精度,如图2(a)所示.由于定位精度与光子数的开方成反比,所以随着光子数的增加,所求得的W(θ)值就越小,也就是其定位精度越高.如图2(b)所示,光子数为1000时,通过所加背景噪声的不同,可以分别求出其不同的三维定位精度.随着背景噪声的增加,定位点的分布就越宽,所求得的W(θ)值就越大,也就是其定位精度越低.光子数为1000和5000时,通过z的取值不同(-1—1µm),可分别求得各个位置处的三维定位精度,如图2(c)—(e)所示.在x,y轴定位精度上,由于其横向定位精度与光斑的大小有关,光斑越小其定位精度就越高.在不同的z轴位置上,最中间的光斑最小,旁边的都随着离焦而有所增大,所以在中点位置的定位精度最高,随着中点依次降低;在z轴定位精度上,其定位精度不仅与光斑尺寸有关,还与两个光斑之间的距离有关,距离越远定位精度越高.离焦越远,两个点之间的距离越大,所以在中点位置的定位精度最低,随着中点依次升高.通过对轴向及横向定位精度随分子所处离焦量的变化曲线可以看到,在焦点位置,横向定位精度达到最高,而轴向定位精度最低.

图2 DH-PSF定位精度模拟图 (a)不同光子数情况下的轴向定位精度;(b)不同背景噪声的轴向定位精度;(c),(d),(e)不同位置处的x,y和z轴定位精度(蓝色为光子数N=1000,红色为光子数N=5000)

4 运用误差传递定律计算DH-PSF的三维质心定位精度

DH-PSF的轴向质心定位精度是由两个旁瓣相对于轴向距离的旋转角来确定的,根据其产生原理,可知旋转角θ为[12]

c为在LG模式平面上所取点的斜率,z0为瑞利长度,ω0为束腰半径.由数学知识我们可知,两个点相对于水平方向的夹角为

把(18)式代入(16)式可得：

误差传递函数定律为[13]

式中σ1(σ2,σ3,σ4)为x1(x2,y1,y2)的标准差,把(19)式代入(20)式则σz为DH-PSF的轴向定位精度.

下面,我们通过计算机进行DH-PSF定位精度的模拟,所有计算均在Matlab编程环境下实现[14].模拟参数如下：样品尺度为12×12个像元,荧光波长λ=670 nm,物镜放大倍率M=100,数值孔径NA=1.4,探测器像元大小为16µm.如图3(a)所示,源图像的生成方法如下：首先,通过(1,1),(3,5),(5,9),(7,13),(9,17)五个LG模式叠加得到DH-PSF的图像;然后,再加上泊松分布的光子散弹噪声和高斯分布的背景噪声,最终获得用于定位的2000幅源图像.模拟实验中,背景噪声均值为2e-/pixel.

图像重构步骤如图3(b)所示.首先,对上面的源图像进行滤波降噪;再把图像分成两个区域,分别求得两个区域的最大值的坐标,并作为高斯拟合的初值,用高斯拟合质心定位算法进行定位,获得4000个定位点,求得这4000个定位点的标准差,代入(20)式即可求得其轴向的定位精度.

通过上面定位算法所求得的轴向质心定位精度与前面计算CRB所得出的FI理论定位精度比较,如图4所示,蓝色为计算CRB所得出的FI理论定位精度,红色为质心定位算法所求定位精度.通过质心定位算法求得的定位精度比FI理论定位精度低(误差数值高),且在光子数比较少的情况下差距比较大,但在光子数比较多时,两个数值基本相同.

图3 定位算法步骤原理图 (a)源图像的生成;(b)图像的重构

图4 质心定位算法(红色)所求得的轴向定位精度与计算CRB(蓝色)所得出的FI理论定位精度比较

5 总结与讨论

通过对DH-PSFFI矩阵的计算,求得其CRB值,表示了它的FI理论三维定位精度.同样,根据质心定位算法也求出了其定位精度.两者相比较可知,运用质心定位精度算法求出的定位精度要比直接运用公式计算CRB所得的FI理论定位精度要低;但是,在光子数大于1000的条件下,二者的差别还是比较小的,基本上一致.由于在光子数少的情况下,信噪比较差,运用高斯拟合质心定位时,造成对质心位置的定位偏差过大,从而造成质心定位精度算法求出的定位精度标准误差增大,即定位精度降低;而在光子数多的情况下,噪声对质心位置定位的偏差较小,因此二者之间的定位精度基本一致.

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