吲哚青绿介导光动力疗法治疗兔眼后发性白内障中视网膜的毒性观察＊

梁毓琳，李 兰△，张远平，李云川，查 旭，戴红梅，曹 倩，李静华，杨文艳

（1.云南省昆明市第一人民医院眼科 650034；2.昆明医科大学附属第二医院眼科，昆明 650000）

吲哚青绿染料（indocyanine green，ICG）是一种水溶性无毒三碳菁燃料，曾广泛应用于眼科各类疾病的检查诊断中。近年来，由于后发性白内障已成为影响白内障患者术后拥有良好视力的主要因素，在研究后发障的实验中，ICG被作为一种光敏剂使用，并于动物实验及体外实验中取得了较好的治疗效果。Melendez的体外实验证实，ICG对晶状体上皮细胞具有光动力毒性，并呈剂量依赖性。在近几年对白内障术后的后发障治疗中，寄予了吲哚青绿更多的期望并加强了对其临床及基础方面的研究。本研究在利用ICG介导光动力治疗后发障实验中，通过透射电镜观察视网膜有无损伤，了解在ICG介导激光治疗后发障实验中后对视网膜有无不良反应。

1 材料与方法

1.1 实验动物 32只新西兰兔，雌雄兼备，体质量2.0～2.5 kg，随机分为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组8只。

1.2 方法

1.2.1 记录仪器 重庆艾尔曦医疗器械设备有限公司生产的IVE 205A电生理检查仪。

1.2.2 刺激参数 采用全视野闪光刺激器，白光刺激，刺激强度为1.6cd·m-2·s-1。

1.2.3 实验步骤 分组后的新西兰兔，行晶状体超声乳化手术，术前房内注入0.5mL浓度分别为1.25mg／mL（低剂量组），2.5mg／mL（中剂量组），5mg／mL（高剂量组）的ICG后分别注入气体，使气体泡与角膜内皮相接触，隔离ICG与角膜内皮的接触，用810nm的半导体激光对囊膜进行低能量（50 mW／cm）照射2min后完毕，冲洗出ICG，关闭切口。术后3个月，按晶状体后囊增生混浊程度并分级，分级标准：按Odrich后囊膜混浊分级法（0级为透明；l级为轻度混浊，能看清眼底或混浊面积小于1／2后囊膜面积；2级为中度混浊，能模糊看见眼底或混浊面积大于1／2后囊膜面积；3级为完全混浊，不能看见眼底。

再对兔眼行闪光视觉诱发电位检查。在视区皮层记录到主要成分为NPN的3相波，其中，P波的出现率为100%，潜伏期最稳定，幅值也较高。故本试验只测量P波的潜伏期、波幅、时程。检查方法为均选取右眼电极，所有家兔均在清醒状态下，充分散瞳中后于暗室内放置30min，支架固定头部，室温18～24℃。记录电极刺于后枕区皮下，枕骨粗隆左右旁开0.5 cm处，参考电极刺于乳突处皮下，接地电极刺于鼻根处［1］。检查结束后处死动物，取出眼球，制作透射电镜视网膜标本。最后分别观察不同组别兔眼视网膜损伤情况。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计学软件进行统计分析，计量资料以表示，兔眼晶状体后发障程度观察结果采用χ2检验，兔眼闪光视觉诱发电位P波采用配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

术后3个月，各组兔眼晶状体后发障程度观察结果（χ2=122.49），差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 术后第3个月晶状体后囊膜混浊情况（n=8）

图1 视网膜电镜图片

经闪光视觉诱发电位检测，实验各组兔眼闪光视觉诱发电位P波经配对t检验潜伏期（t=0.374，r=0.033），波幅（t=2.187，r=0.251）、时程（t=1.766，r=0.566）与对照组比较均无较大差异（P＞0.05）。见表2。

表2 各组闪光视觉诱发电位的P波潜伏期、波幅、时程（，n=8）

表2 各组闪光视觉诱发电位的P波潜伏期、波幅、时程（，n=8）

组别 潜伏期 波幅 时程对照组113.37±15.25 8.85±1.90 68.58±7.99低剂量组 111.01±8.81 10.54±1.64 63.94±7.97中剂量组 105.13±14.22 9.60±1.57 60.01±8.59高剂量组110.64±12.33 9.75±2.31 63.07±5.39

视网膜透射电镜检查可见使用ICG各组兔眼视网膜结构均有不同程度损伤，以神经节细胞，膜盘水肿，以及线粒体损伤较明显，其中低剂量组兔眼视网膜损伤相对较轻，双极细胞与水平细胞胞质存在。RPE细胞层呈单细胞排列无水肿等改变，与视网膜神经层黏附良好，损伤层次局限于视锥细胞层。而中剂量组及高剂量组则可见视网膜全层均有不同程度损伤。对照组视网膜各层未见损伤，见图1。

3 结 论

ICG原被用于视网膜和脉络膜血管造影四十年，因其分子大，可与蛋白结合，对光敏感，吸收峰（805nm）与传统半导体激光波长（810nm）相近，皮肤光毒性低，组织靶向性高，生物分布和清除迅速，使用操作简单等特点使近年来其眼科用途逐渐扩大，已广泛用于眼底视网膜手术中。但目前经临床随访和实验研究发现ICG在眼内使用，无论是单独使用或联合光照都具有潜在的神经毒性和视网膜毒性［2-3］。Rezai等［4］研究发现，ICG作用于RPE后明显提高其凋亡率。Haritoglou等［5］对10例ICG染色后剥除的内界膜用透射电子显微镜进行分析显示，视网膜内界膜面有Muller细胞的损伤和细胞破裂。推测与ICG属于高分子物质，具有很强的亲水性，溶解后包浆渗透提高，造成细胞水肿有关。王文莹等［6］发现，ICG对体外培养RPE细胞生长有明显抑制作用并呈浓度和时间依赖性。考虑为体内多种细胞可主动转运摄取ICG，导致细胞内ICG浓度较高后细胞水肿。多项实验证明了ICG长期存留对眼组织有潜在的危险［7］。国内何晓静等［8］研究发现，经光动力治疗后，细胞外节段排列轻微紊乱，RPE细胞轻微内质网扩张，其内可见髓样小体。考虑机制为当激光作用于视网膜时，视网膜色素上皮的损伤，色素屏障受得破坏，结果提示能量能对光感受器和色素上皮起作用［9］。宋志杰等［10］在使用ICG染色视网膜内界膜治疗黄斑裂孔时亦发现其药物毒性与剂量呈相关，并随随访时间的延长，视网膜水肿能够逐渐减轻。李雁杰等［11］研究亦发现无论是低浓度还是高浓度的ICG直接用于都会对视网膜造成损伤。

本实验中ICG虽不直接作用于眼底，但药物滞留于后囊膜3个月，通过缓慢代谢，可能有部分ICG弥散到玻璃体腔及视网膜前造成损害，并可能随浓度增加和作用时间延长，对细胞毒性作用逐渐增强。为了解ICG引导光动力治疗后发障后是否也存在对视网膜细胞的毒性作用，从而更加全面评价本实验的治疗价值和不良反应，对不同药物浓度组别分别观察视网膜电镜结果，同时行闪光视觉诱发电位检查。本实验设立了手术对照组，目的是为了了解手术是否会对视网膜造成损伤。手术对照组术后3个月电镜显示视网膜各层排列整齐、层次清晰，与正常兔眼视网膜电镜图片对比未见明显结构改变。说明该手术对视网膜结构无明显影响。

本实验表明，利用ICG介导的光动力作用在治疗兔眼后发障有效的同时，因ICG缓慢的弥散至玻璃体腔，不同浓度的ICG组均能对视网膜造成损伤，并呈剂量相关。低剂量组损伤较轻，高剂量组则损伤相对增多，在本实验中以浓度为1.25 mg／mL ICG治疗时损伤最少。结果与各类实验中将ICG直接用于视网膜前结果类似。同时实验各组未造成RPE的脱离及细胞凋亡，闪光视觉诱发电位与对照组P波潜伏期，波幅及时程比较均无明显差异，且与正常兔眼闪光视觉诱发电位实验值较为接近［12］。可考虑今后在进一步利用ICG介导光动力防治晶状体后发障时，采用低浓度组治疗，以在取得治疗效果的同时将视网膜损伤降为最低。

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［5］Haritoglou C，Gandorfer A，Gass CA，et al.Indocyanine green-sisted peeling of the internal limitingmembme in macular holesurgery affects visual outcome：a elinicopathologic correlation［J］.Am J Ophthalmol，2002，134（6）：836-841.

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［10］宋志杰，吕林.降低吲哚青绿着染内界面对黄斑区毒性的研究［J］.中国实用眼科杂志，2007，1（25）：105-107.

［11］李雁杰，成霄黎，王丽聪.玻璃体手术中吲哚青绿对视网膜结构的影响［J］.山西医药杂志，2007，11（36）：980-982.

［12］卜博，周定标，许百男.兔闪光刺激视觉诱发电位正常值测定［J］.中国临床康复，2006，70（6）：46-47.