壮通饮对大鼠内源性神经干细胞分化作用的研究1）

陈晓锋，王婧婧，陆 惠

干细胞是机体在发展适应过程中保留的一部分未分化的原始细胞，是具有全部或部分分化能力的细胞，在一定条件下这些干细胞可以增殖和分化成多种功能的细胞或组织器官。内源性干细胞（neural stem cells，NSC）是来自机体本身的干细胞，是储备在人体内的巨大修复潜力的干细胞，侧脑室壁的室管膜下区和海马齿状回的颗粒下区是内源性神经干细胞主要集中区域［1］。内源性神经干细胞在一定条件下可以分化产生神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞［2］。壮通饮作为临床治疗脑梗死的壮医药经验方，主要由扶芳藤、参三七、黄花倒水莲三味特色壮药配伍而成。扶芳藤及参三七有促进干细胞增殖作用，但这些都是拘于对该方中单味药进行的研究。本实验通过壮通饮对诱导新生大鼠海马NSC分化过程的研究，阐明壮通饮促进神经再生机制提供实验依据。

1 材料与方法

1．1 实验动物 新生 Wistar大鼠，由广西医科大学动物实验中心提供。

1．2 主要试剂 一抗为鼠抗巢蛋白（Nestin）、神经元核心抗原（NeuN）和髓鞘碱性蛋白（MBP）单克隆抗体以及胶原纤维酸性蛋白（GFAP）多克隆抗体（Sigma）；ABC试剂盒、FITC羊抗兔IgG购自武汉博士德生物工程有限公司。

1．3 药物制备 壮通饮：扶芳藤30g，三七10g，黄花倒水莲25g。药材去除杂质切制后，按组方剂量配比，加入生药材10倍量的水，浸泡60min后，用TC－15套式恒温器250V电压加热煎煮。沸腾后将电压调低至150V，保持微沸状态煎煮1h，滤取煎液。药渣再加入生药材8倍量的水，同法煎煮1h，滤取煎液。合并两次煎液，于恒温水浴锅（100℃）蒸发去水分至浓稠状，转入恒温烘箱（60℃）干燥，得干浸膏，称重，收膏率为36．80%，4℃保存，备用。临用前使用蒸馏水溶解浸膏至生药材含量为2．0g／mL。

1．4方法

1．4．1 原代培养 取新生当天 Wistar大鼠，乙醇消毒后断头取脑，取双侧大脑海马区于D－Hanks液中，剥离出脑膜及血管，用眼科剪剪碎成糊状，加DMEM／F12培养液（Hyclone），用细口吸管机械吹打，200目金属滤网过滤后获得单细胞悬液并计数，以5×105／mL的细胞浓度接种到培养瓶中，加入2%B27、终浓度为20ng／mL的EGF和bFGF（均为Gibco产品）后置37℃、5%CO2恒温孵箱中培养每3d～4d进行半量补液。培养7d～9d后，机械分离神经球进行传代［3］。

1．4．2 传代培养 将原代培养7d～9d形成的神经球（50～200个细胞／球）悬液移至离心管，低速离心后吸弃上清液，机械吹打制成单细胞悬液后，再以5×105／mL细胞密度接种培养。以后每6d～8d传代1次［4］。

1．4．3 神经干细胞分化及壮通饮诱导作用 培养的第2代神经球收集，以约2×105／mL的细胞密度接种于24孔培养板各孔中。孔底放置预先用100mg／L多聚赖氨酸处理过的盖玻片，每块培养板分对照组和20mg／L、40mg／L、80mg／L壮通饮组，每组6孔。对照组培养液为原有培养液去除bFGF及EGF，另加10%胎牛血清（FBS）配制。壮通饮组培养液是在对照组培养液基础上加入壮通饮，浓度分别为20mg／L、40mg／L和80 mg／L。将培养板置饱和湿度、37℃、5%CO2孵箱中培养。

1．4．4 神经干细胞鉴定 以神经干细胞标志物Nestin鉴定增殖期NSC，并检测各组分化培养7d时Nestin以及NeuN、GFAP和MBP（分别为神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞标志物）表达情况。取出24孔培养板各孔中的盖玻片，以4%多聚甲醛固定后，0．01mol／L PBS冲洗。检测Nestin用免疫荧光方法，加一抗37℃孵育60min，FITC标记的二抗孵育30 min，甘油缓冲液封片后荧光显微镜下观察。余采用免疫细胞化学ABC改良法。DAB或BCIP／NBT显色，着棕黄色或紫蓝色的细胞为阳性。其中小鼠抗NeuN及兔抗GFAP为1∶500、小鼠抗MBP为1∶200。Olympus倒置显微镜及普通光学显微镜下观察并拍照。在200倍数下，每个盖玻片上随机选5个视野，计算平均阳性细胞数。

2 结 果

2．1 NSC的体外原代及传代培养 培养1d细胞呈圆形亮点，2d～3d可见有数个细胞形成的哑铃样结构，4d～5d可以见到几十个细胞形成的神经细胞球（neurosphere），6d可见神经球明显增大，直径达100μm～150μm，8d～10d大的神经球直径已达到150μm～200μm。原代及多次传代培养（目前在本实验室条件下已传10代）形成克隆球的细胞圆润饱满，边界清晰，活力状态佳，经鉴定Nestin表达阳性。

2．2 壮通饮对体外培养神经干细胞分化的影响 在去除bFGF及EGF，加10%胎牛血清配制的培养基培养7d后，神经干细胞部分分化为NeuN染色阳性的神经元、GFAP染色阳性的星形胶质细胞和MBP染色阳性的少突胶质细胞。NeuN阳性神经元的胞体呈圆形或锥体形，有较长轴突。GFAP阳性星形胶质细胞的胞体稍小，胞突长而直，分支较少。MBP阳性少突胶质细胞的胞体更小，呈扁平状，突起比神经元样细胞和星形胶质样细胞的少。添加壮通饮培养7d后表达Nestin抗原的阳性细胞数较对照组明显增加（P＜0．05），而且表达 NeuN （P＜0．05）、GFAP及MBP的阳性细胞数较对照组也明显增多（P＜0．01）。随壮通饮浓度增加NeuN阳性细胞数逐渐增多（P＜0．01），但GFAP及MBP阳性细胞数壮通饮各剂量组无统计学意义。详见表1。

表1 壮通饮对神经干细胞分化的作用（±s）

表1 壮通饮对神经干细胞分化的作用（±s）

与对照组比较，1）P＜0．05；与其他剂量壮通饮组比较，2）P＜0．05

组别Nestin NeuN GFAP MBP对照组16．7±1．5 17．1±1．7 22．4±2．4 5．9±1．4 20mg／L壮通饮组 20．2±1．41） 20．3±1．91） 28．2±3．71） 8．1±2．31）40mg／L壮通饮组 23．6±1．91） 24．5±2．81）2） 28．8±4．01） 8．5±2．61）80mg／L壮通饮组 32．8±2．21） 28．2±3．61） 30．1±3．61） 8．9±3．21）

3 讨 论

近年来研究发现［5］，在哺乳动物中枢神经系统存在NSC，主要分布在海马、纹状体、脑室下区、嗅球以及发育过程中的大脑皮质和脊髓。本实验应用无血清培养技术从新生大鼠大脑海马中分离、培养成细胞悬浮球，经鉴定呈Nestin阳性。Nestin［6－8］即巢蛋白，又名神经上皮干细胞蛋白，属于中间丝蛋白，主要在神经干细胞内一过性表达，当干细胞向着终末细胞分化完成后，其表达停止，成熟细胞有着特异的表达标志物，所以巢蛋白被广泛用于神经干细胞的标记物质，Nestin阳性表明为神经干细胞分化。

体外培养的神经干细胞与其所处微环境关系密切，其中主要因素就是培养基质中的各种细胞因子，这些因子的成分和浓度能决定神经干细胞的增殖及其分化方向［9，10］。因此，利用某种药物对体外神经干细胞进行定向诱导增殖和分化，为中枢神经系统损伤修复的治疗带来了新的希望。壮通饮中的扶芳藤对小鼠外周血造血干细胞有明显的动员作用，并具有作为有效干细胞动员剂的潜力［11］；三七总皂甙可以提高脑梗死患者骨髓干细胞动员率［12］；三七总皂甙能够促进新生大鼠海马神经干细胞分化，有促进干细胞增殖的作用［13］，但这些都是拘于对该方中单味药进行研究，壮通饮是否能够诱导大脑海马区NSC增殖分化，迄今缺乏明确的实验证据。本实验研究发现，在NSC分化期，添加壮通饮后，表达Nestin抗原的细胞数较对照组明显增加，同时表达NeuN、GFAP和MBP的阳性细胞数量显著增多。其中NeuN（神经元核心抗原）在神经元分化成熟后开始表达，是成熟神经元的特殊标志物［14，15］；胶原纤维酸性蛋白是星形胶质细胞的特征性标志物［16］；髓鞘碱性蛋白是少突胶质细胞的特征性标志物［17］。壮通饮能够促进新生大鼠大脑海马NSC的分化和增殖。在相同接种密度下对比三种不同剂量壮通饮组分化产生的阳性细胞数，可以看出在本实验剂量范围内，壮通饮浓度越大，分化形成的神经元细胞越多，而壮通饮对NSC分化为星形胶质细胞和少突胶质细胞虽有促进作用，但与其浓度的关系不大。提示壮通饮对NSC尚具有一定的定向诱导分化作用。

本实验证实，壮通饮能诱导大脑海马区NSC分化，具有一定的促进神经再生的作用。

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