丹参注射液对急性脑梗死大鼠脑组织VEGF表达的影响1）

赵 宁，陆 琳，杨万章，林 慧，王碧涵

急性脑梗死（ACI）往往导致患者运动、感觉、语言、认知、吞咽及精神情感障碍。神经系统及脑血管损伤后，神经营养因子的表达会发生改变，这些改变与血管及神经系统的可塑性之间有重要关系。血管内皮生长因子（VEGF）作为血管发生的神经营养因子，是促进血管新生、重建微循环所必须，亦同样具有神经保护和神经再生作用［1］。本研究用具有活血化瘀作用的丹参注射液腹腔注射，从改善ACI后微环境着手，观察与血管神经重塑密切相关的VEGF表达和神经功能缺损评分的变化，并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1．1 实验动物 选取健康成年雄性SD大鼠60只（广州中医药大学实验动物中心提供），8周龄，体重250g～300g。饲养于正常昼夜环境中，给予标准饲料及饮水。

1．2 脑梗死大鼠模型的制备 大鼠麻醉固定。钝性分离胸骨舌骨肌、胸骨锁骨肌、肩胛舌骨肌。镜下分离暴露左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA），结扎颈内动脉的分支翼腭动脉（PPA）。电凝ECA的分支－枕动脉、甲状腺上动脉、咽升动脉、上颌外动脉，结扎并游离ECA的主干。在ECA残端剪一0．2mm的小口，将线栓插入，为防止尼龙线滑出和出血，将颈外动脉的备用丝线系紧 ，然后松开ICA和CCA处的活结。拉动ECA残端，使ECA与ICA成一条直线，将线栓向ICA插入，待线拴头端通过ICA与PPA分叉处后，松开PPA处的活结。继续将线栓插入大脑前动脉近端，此时线栓插入深度为（18．5±0．5）mm，并在ICA与PPA分叉处扎紧ICA，分层缝合皮肤。把大鼠放在复苏盒内，待大鼠清醒后单独饲养，自由摄取水和食物。

1．3 入选标准 大鼠手术后12h根据Zeal Longa的5分制评分标准进行神经功能学评分，1分～3分大鼠入选，成功模型选入实验研究。

1．4 分组及给药 入选大鼠先按给药的方式分为3组：A、B及C组。A组：丹参注射液组；B组：对照组；C组：假手术组，每组12只。从造模成功至实验取材期间每日腹腔注射丹参注射液，0．5mL／次，1次／日，临床用量：30g生药／20（mL·d）。丹参注射液临床等效剂量＝30g生药／日×0．018×5＝2．7g生药／（kg·d）或2mL／（kg·d）。按大鼠体表面积折算丹参注射液等效剂量：250g～300g大鼠的中剂量为0．5mL／d～0．6 mL／d，大剂量为1mL／d～1．2mL／d，小剂量为0．25mL／d～0．3mL／d，此研究中使用中剂量，按分组方案执行使用疗程。丹参注射液组：从造模成功开始连续使用丹参注射液腹腔注射，0．5mL／次，1次／日，连用7d。模型对照组：从造模成功开始连续使用与丹参注射液等剂量的生理盐水，连用7d。假手术组：大鼠入选后不予用药。

1．5 检测指标

1．5．1 神经功能损伤程度评分（NSS） 造模完成后1d、3d及7d评分。评分范围0～18分，分数越高表明大鼠的神经功能缺损越重。

1．5．2 脑组织VEGF表达 ELISA法检测：加入100μL配制好的每个标准品和样品到反应孔中，用覆膜盖好并37℃温育2 h。弃去孔内液体。每孔加检测液A 100μL，晃匀后加上覆膜，37℃温育60min。弃去孔内液体并用稀释好的洗涤液洗板3次。每孔加检测液B 100μL，37℃温育60min。加入90μL底物到每个反应孔。避光，37℃温育30min。加入50μL终止液到每个反应孔中，立即用酶标仪在450nm波长下依序测量各孔的光密度（OD值）。根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数，即为脑组织VEGF浓度。

1．6 统计学处理 采用SPSS18．0统计软件，对数据资料进行正态分布检验，符合正态分布多组资料采用单因素方差分析，两组资料采用两独立样本t检验；不符合正态分布者进行数据转化后比较，结果以均数±标准差（±s）表示。

2 结 果

2．1 3组大鼠神经功能评分 在脑梗死后，丹参注射液组和对照组表现出一致性变化趋势，均有下降趋势，假手术组基本无变化，只作为正常对照，不做特殊讨论。丹参注射液组在3d、7d两个时间点与对照组比较，NSS评分有明显下降（P＜0．01），丹参注射液腹腔注射后能从行为学上改善大鼠的神经功能。详见表1。

表1 3组大鼠神经功能评分（±s） 分

表1 3组大鼠神经功能评分（±s） 分

与对照组比较，1）P＜0．01；与假手术组比较，2）P＜0．01

组别 n 1d 3d 7d丹参注射液组 12 9．25±2．05 4．67±1．831）2） 4．08±1．881）2）对照组 12 9．33±2．70 7．91±2．022）3） 7．75±1．542）假手术组 12 0 0 0

2．2 3组大鼠治疗后VEGF表达 在脑梗死后，3组VEGF表达呈现不一致性变化趋势，丹参注射液组在3d及7dVEGF浓度高于对照组及假手术组，血液中VEGF浓度太低，无法测定。丹参注射液组与对照组比较，脑组织VEGF有增高趋势，提示丹参注射液可上调ACI后VEGF的表达（P＜0．05）；丹参注射液组与假手术组比较，脑组织VEGF有增高（P＜0．05）；对照组与假手术组比较，对照组VEGF有增高趋势，表明ACI后，脑组织VEGF会应激性增高（P＜0．05）；丹参注射液3d和7d两个时间点相比，VEGF表达，差异无统计学意义。丹参注射液能延缓ACI后VEGF下调的时间，持续刺激VEGF的高表达，对于促进神经及血管的修复有积极的意义。详见表2。

表2 3组脑组织VEGF表达（±s） pg／mL

表2 3组脑组织VEGF表达（±s） pg／mL

与对照组比较，1）P＜0．05；与假手术组比较，2）P＜0．05

组别 n 3d 7d丹参注射液组 12 230．34±59．391）2） 264．30±55．911）对照组 12 179．73±35．282） 194．24±30．92假手术组 12 142．19±28．56 142．19±28．56

3 讨 论

急性脑梗死后神经功能缺损的本质是中枢神经细胞的坏死，一般认为中枢神经细胞是终末分化细胞，缺乏再生能力。脑梗死后，除损伤区域的神经组织直接受损外，由此导致的继发性动力性损伤也很重要。祖国医学认为急性脑梗死属于“中风”的范畴，无论从病因病机分析，都存在“瘀血阻络”的因素，因此活血通络对于急性脑梗死的治疗尤为重要。而丹参注射液的作用主要着眼于“活血化瘀”这个环节，这也为本实验提供了客观的理论依据。

既往的研究已证实，VEGF是一种多效性血管生长因子，具有促进内皮细胞增殖，提高血管通透性等生物学特性，在缺血的脑组织中对于神经血管重塑发挥着至关重要的作用。一方面VEGF能够促进血管内皮细胞分裂增生迁移、增强毛细血管的通透性、增加脑血流［2］、具有强效的抗炎、抗凋亡［3］以及免疫抑制特性的作用［4］；另一方面VEGF及其受体还是一种独立的神经保护因子，对神经元及神经胶质细胞有保护效应［5］，可以增强神经前体细胞的募集及增殖作用，能够直接促进损伤后的大脑皮层神经元再生、突触重塑以及健侧皮质延髓束长距离轴突的再生［6］。因此，VEGF的血管修复性、亲神经性及神经细胞保护性，成为联系血管生成和神经再生中最重要的“枢纽”。

丹参为唇形科植物，味苦，性微寒。具有活血祛瘀、养血安神、调经止痛、凉血消痈的功效。丹参的有效成分主要分为脂溶性和水溶性两大类。丹参注射液属于水溶性药物，以酚性酸类化合物为主。药理研究表明丹参注射液中的单体成分丹酚酸B可促进内皮细胞分泌某些细胞因子，并促进毛细血管的形成［7］，丹酚酸B的代谢产物SMND－309可通过激活EPO受体／STAT3信号通路上调VEGF的表达促进血管的发生［8］，丹参注射液中其他单体成分如丹参酮、丹参素均能促进干细胞向神经元巢蛋白及丝蛋白方向分化［9，10］，分化过程中可产生与细胞生长相关的神经营养因子，如VEGF、IGF及BFGF等，这些细胞因子可通过自分泌或旁分泌的方式，刺激局部血管和神经元细胞的增生，抑制缺血区神经元细胞凋亡，在改善神经缺损功能方面起着十分重要的作用。另外，丹参注射液自身还能促进心肌梗死大鼠缺血心肌VEGF、BFGF及PDGF－B蛋白的表达［11］，发挥促血管新生及脑保护的作用。

本实验丹参注射液组中大鼠脑组织VEGF在3d和7d两个时间点均呈高表达、NSS评分下调，与对照组、模型组比较有统计学意义，丹参注射液在急性脑梗死大鼠模型中，可促进大鼠脑组织中VEGF的分泌，改善大鼠神经行为学的功能，丹参注射液可通过上调VEGF的水平，优化局部的微环境，而局部VEGF的持续增多，又可能特异性作用于血管内皮细胞、神经细胞（包括神经元、星型胶质细胞及少突胶质细胞）促进血管及神经的共同修复［1］，对于加强血管发生及神经重塑的联系有积极作用，具有进一步的研究价值。

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