蛋鸡J亚群白血病临床、病理和病原学研究

齐鹏飞，李卫华，何羽婷，赵 鹏，崔治中

（1．山东农业大学动物科技学院，山东 泰安271018；2．中国动物卫生与流行病学中心，山东 青岛266032）

禽白血病病毒（ALV）属于反转录病毒科反转录病毒属，可引起禽类多种肿瘤性疾病。共10个亚群，其中 A、B、C、D、E、J存在鸡群中［1］。1989年，白羽肉鸡中发现了致病性和传播能力都很强的ALV－J，给肉鸡业造成巨大损失［2］。过去十几年，ALV－J的发病日趋严重，蛋鸡发病率也明显增高，国内有不少ALV－J诱发蛋鸡肿瘤／血管瘤的报道［3－5］，多为单个病例。2010年山东某鸡场暴发肿瘤性疾病，我们从6 000余只的群体中随机抽取28只，做连续50d临床病理观察并逐只做病毒分离鉴定。

1 材料与方法

1．1 病鸡来源 新泰某蛋鸡场，饲养8 000余只海蓝褐蛋鸡，90日龄发病，临床主要表现血管瘤，240日龄剩6 000余只。

1．2 观察大体病变及剖检 连续观察病鸡50d，记录发病及死亡情况，最后剖检。

1．3 病毒分离鉴定

1．3．1 病毒分离 采无菌抗凝血，血浆接种DF－1，2 h后换液维持7d检测上清p27，确定是否外源ALV感染。

1．3．2 间接免疫荧光试验（IFA） p27阳性细胞消化后接种于放有盖玻片的平皿里培养9d，固定盖玻片上细胞，ALV－J特异性单抗JE9［6］为一抗，FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗，荧光显微镜观察。

1．3．3 模板DNA制备env基因扩增及亚群确定DF－1接毒后维持7d，提取细胞DNA，扩增env基因［7］。为确定病毒亚群，据参考文献［8］，扩增env基因的引物 F：5′－GGATGAGGTGACTAAGAAGG－3′；R：5′－ACACTACATTTCCCCCTCCCTAT－3′，PCR 产物（预期大小约2．2kb）电泳回收纯化，连接转化后筛选阳性克隆测序。DNAStar比较7个分离株与Gen－Bank中已发表的各亚群ALV的gp85氨基酸序列的同源性，确定亚群。比较同一毒株5个不同准种。参考株基本信息见表1。

2 结果

2．1 病鸡群长期观察及剖检病理变化 35只鸡因应激等原因死亡7只，饲养中死亡7只，21只做了病毒分离。主要表现肝、脾肿大，白色增生性肿瘤结节。部分有肝脏或趾部血管瘤，15号左腿变粗并有肿瘤组织于胸骨下、肠系膜处。见表2。

表1 各亚群参考株基本信息

表2 病鸡群长期观察及剖检病理变化

2．2 病毒分离和鉴定 将病鸡血浆接种DF－1后培养7d，检测上清液p27均阳性，表明这些鸡均存在外源ALV感染。

2．3 IFA检测 所有p27阳性的细胞均显示胞质绿色荧光、胞核无荧光的典型感染（图1）。确定分离到ALV－J，分别命名SDAU10C1－21（表2）。

图1 SDAU10C1接种DF－1细胞培养9d后IFA结果

2．4env基因扩增和gp85氨基酸序列同源性比较PCR产物电泳，凝胶成像仪下观察分子量标记2kb处有特异性条带，约2．2kb，符合预期。gp85氨基酸序列同源性比较显示，这7个分离株与ALV－J同源性最高，87．1%～95．5%，7个分离株间gp85同源性95．2%～98．2%（表3）。5个准种间同源性98．1%～100%（表4）。

表3 SDAU10C1与各亚群参考株gp85氨基酸序列同源性比较

表4 SDAU10C1株五个准种间gp85氨基酸序列同源性比较

3 讨论

ALV－J是从肉鸡中首次发现和分离鉴定的新亚群［2］。自2003年国内首次报道蛋鸡ALV－J越来越多的报道显示，ALV－J在我国蛋鸡中流行日趋严重［11］。商品代蛋鸡的白血病会引发很高死淘率，带来巨大经济损失，因为这种死亡通常发生在性成熟后开始产蛋时［12］。由此，不断引发商品代蛋鸡场和种鸡场纠纷。

本文对来自严重发生ALV－J诱发的肿瘤／血管瘤鸡群的28只可疑病鸡做了50d连续的临床和病理观察，显示了多种多样的临床表现和病理学变化，分 离到2 1株ALV－J。对7株克隆测序，gp 8 5氨基酸序列同源性与A～E亚群50．8%～52．7%，与J亚群86．9%～95．5%。与原型株 HPRS－103同源性95．0%，与另一原型株 ADOL－7501同源性86．9%，与海蓝灰蛋鸡分离株SD07LK1同源性92．6%。可见，近年来ALV－J的gp85变异很快并发生了同源回归［9－10］。这7株间同源性95．2%～98．2%，同一毒株5个准种的同源性98．1%～100%，一定程度上说明gp85有很高变异性。ALV－J引起的肿瘤形态多种多样，有血管瘤、肝、脾增生性结节、骨硬化，有的无特征性肿瘤变化，仅表现消瘦。这些差异的产生可能与基因组变异性相关，也可能由个体差异引起。对一群可疑病鸡做长期逐日临床病理观察，国内还是首次，有助于更深入地了解白血病的发病过程和病变多样性。

HPRS－103是迟发型致瘤病毒。近年出现的一些毒株，自然感染情况下即可引发5周龄肉鸡髓细胞 瘤，并 伴 随 较 高 的 传 染 性 和 发 病 率［12］。SDAU10C1人工感染后8d使不同日龄、品系鸡发生肿瘤，是急性转化型病毒。

［1］ Fadly A M，Nair V．Leukosis／Sarcoma Group［M］／／Saify M，Fadly A M，Diseases of Poultry．12thed．Blackwell Publishing Ames，2008：514－568．

［2］ Payne L N，Browns R，et al．A novel subgroup of exogenous avian leukosis virus in chickens［J］．Journal of General Virology，1991，72：801－807．

［3］ Sun S H，Cui Z Z．Epidemiological and pathological studies of subgroup J avian leukosis virus infections in Chinese local yellow chicken［J］．Avian Pathol，2007，36；221－226．

［4］ 王辉，崔治中．蛋鸡J亚群白血病病毒的分离鉴定与序列分析［J］．病毒学报，2008，24：369－375．

［5］ 孙淑红，崔治中．表现腺胃炎的蛋用型鸡J亚群白血病病毒的分离鉴定［J］．畜牧兽医学报，2010，41（2）：251－254．

［6］ Qin AJ．Development and characterization of monoclonal antibodies to subgroup J avian leukosis virus［J］．Avian Dis，2001，45（4）：938－945．

［7］ 朱美真，崔治中．山东地方品系鸡中一株ALV－A的分离和鉴定［J］．中国动物传染病学报，2009，31（4）：31－35．

［8］ 赵东敏，崔治中．芦花鸡中B亚群禽白血病病毒的分离与鉴定［J］．病毒学报，2010，45（1）：53－57．

［9］ 张志，赵宏坤，崔治中．我国2000～2001年J亚群禽白血病病毒分离株gp85基因的序列比较［J］．中国兽医学报，2003，25（1）：25－27．

［10］王增福，崔治中．我国1999－2003年间 ALV－J野毒株gp85基因变异趋势［J］．中国病毒学，2005，20（4）：393－398．

［11］徐镔蕊，董卫星，何召庆，等．间接荧光抗体法快速诊断海兰褐蛋鸡J亚群禽白血病的研究［J］．中国兽医杂志，2002，38（9）：7－9．

［12］崔治中．鸡白血病及其鉴别诊断和预防控制［C］／／鸡淋巴白血病防控技术研讨会论文集，北京：中国畜牧兽医学会禽病学分会，2010：1－12．