正交设计法优选芪参口服液提取工艺

王建舫，崔 昊，高会军，姜代勋，董 虹，穆 祥

（1．北京农学院 兽医学（中医药）北京市重点实验室，北京 昌平 102206；2．石家庄华牧牧业有限责任公司兽药分公司，河北 石家庄 050061）

芪参口服液是由传统的中药方剂四君子汤加减而来。方中黄芪益气健脾为君药；人参补中益气为臣药；白术苦温，健脾燥湿为佐药；甘草甘温，益气和中，调和诸药为使药。诸药相合，共奏补中益气、健脾胃之功效。前期的临床研究证实，该制剂能够增强鸡的免疫能力。因此，为推动芪参口服液的临床应用开发，本试验根据处方中药材有效成分的理化性质和药理作用，选择以干膏率和芪参口服液中主要药效成分之一的黄芪甲苷提取量［1－6］为定量检测指标，采用L9（34）正交试验对药物加水量、煎煮时间和煎煮次数加以考察，对芪参口服液的水提工艺进行了优化研究。

1 材料与方法

1．1 仪器 Waters2695高效液相色谱系统，Waters2424蒸发光检测器，Empower工作站，日本YMC－Pack ODS－A色谱柱 （5μm，150mm×4．6 mm）。美国Millipore水纯化系统，针筒式微孔滤膜过滤器（上海兴亚净化材料厂产品，孔径0．45μm）。旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂，RE－3000A）。电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司，DHG－9145A）。电子分析天平（Sartorius，CP423S）。

1．2 药品与试剂 黄芪甲苷对照品（批号：110781－200613，购自中国药品生物制品检定所）；乙腈（色谱纯，天津市光复精细化工研究所）。黄芪产自甘肃省，人参产自吉林省，白术产自河北省，甘草产自内蒙古，以上4味药材，均购自河北省安国市淤校中药材栈。

1．3 正交试验设计

1．3．1 因素水平的选择 以加水量、煎煮时间和煎煮次数为考察因素，各取3个水平，进行L9（34）正交试验。筛选最佳工艺条件，因素水平表见表1。

表1 正交试验设计因素水平

1．3．2 样品的制备 按处方量，称取黄芪、人参、白术和甘草4味药材，混合后浸泡1．0h，按照表2正交试验设计方案水煎提取，提取液混合后过滤、浓缩至1g／mL、放冷，置250mL玻璃瓶中备用。

1．4 干膏率的测定 精密量取工艺研究样品20 mL，至蒸发皿蒸干，于105℃干燥至恒温，称重得干膏重（g），计算干膏得率。公式为：干膏率＝（干膏重／生药材重量）×100%

1．5 黄芪甲苷含量的测定

1．5．1 色谱条件 色谱柱：YMC－Pack ODS－A 柱（5μm，150mm×4．6mm）；流动相：乙腈∶水＝35∶65；流速：1．0mL／min。蒸发光检测器：增益：1000；氮气压力：30psi；喷雾器温度：36℃；漂移管温度：65℃。

1．5．2 溶液的制备 对照品溶液：精密称取黄芪甲苷对照品1．2mg，置10mL容量瓶中，定容至刻度，制成每毫升含1．2mg的黄芪甲苷对照品溶液，摇匀，即得。

供试品溶液：精密量取本品20mL，用水饱和正丁醇振摇5次，每次25mL，合并正丁醇液；用氨试液振摇洗涤2次，每次20mL，合并正丁醇液；用蒸馏水洗涤2次，每次20mL，弃去水液；正丁醇液蒸干，残渣加5mL甲醇使溶解作为供试品溶液。测定时过0．22μm微孔滤膜，取10μL进样。

阴性（缺黄芪）对照溶液：取缺黄芪的阴性样品20mL，按供试品溶液制备项下的方法操作，得阴性对照溶液。

1．5．3 专属性试验 按上述仪器和试验条件，吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各10μL，注入液相色谱仪。

1．5．4 线性关系考察 精密吸取5、10、15、20、25、30、35μL对照品溶液注入色谱仪，测定峰面积。以对照品进样量的对数值为横坐标，以对照品峰面积的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。

1．5．5 精密度试验 取线性项下的同一份对照品溶液，连续进样6次，每次进样10μL，测定峰面积，结果精密度试验相对标准偏差（RSD）为1．67%，精密度符合规定。

1．5．6 重复性试验 用同一批样品溶液，重复配制6份供试品溶液，各取10μL注入色谱仪，结果6份供试品峰面积RSD为2．60%，重复性符合规定。

1．5．7 溶液稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别在0、2、4、6、8和10h进样10μL，测定峰面积，结果表明，供试品溶液10h内峰面积相对标准偏差RSD为2．03%，表明样品溶液在10h内稳定。

1．5．8 加样回收率试验 精密量取已知含量的同一批样品6份，按照供试品项下制备6份供试品溶液，分别精密加入5mL黄芪甲苷对照品溶液，取10 μL注入色谱仪，记录色谱图，计算加样回收率。结果6份样品平均回收率为97．88%，RSD为3．20%，表明回收率良好。

1．5．9 样品的测定 按供试品溶液制备项下方法分别制得9批工艺样品溶液，按照上述色谱条件，测定黄芪甲苷的峰面积，用对数外标法计算其含量。

2 结果

2．1 专属性考查

吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10μL，注入液相色谱仪中，按上述色谱条件，进行测定。结果在黄芪甲苷对照品色谱峰相应的位置上，供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰，阴性对照溶液在此保留时间处未见明显的色谱峰，说明杂质对本品黄芪甲苷含量测定无干扰，方法专属性强（见色谱图1～3）。

2．2 线性关系考察 经对不同体积的黄芪甲苷对照品进行测定，得回归方程为：y＝1．7327x＋3．7372，R2＝0．9989，r＝0．9994。结果表明，黄芪甲苷在0．60～6．00μg范围内，峰面积的对数值与黄芪甲苷进样量的对数值具有良好的线性关系。

2．3 干膏率的测定 精密量取工艺研究样品20 mL，至蒸发皿蒸干，于105℃干燥至恒温，称重得干膏重（g），结果见表2。

图4 黄芪甲苷的标准曲线

2．4 黄芪甲苷含量的测定 9批工艺样品溶液，按照上述色谱条件进行测定，测定结果见表2。

2．5 工艺的综合评定 正交试验两个评价指标干膏率和黄芪甲苷含量，采用综合评分进行数据分析，干膏率和黄芪甲苷含量的权重系数均为0．5计。干膏得率评分＝（样品干膏得率／最大干膏得率）×0．5×100；黄芪甲苷含量评分＝（样品黄芪甲苷含量／最大黄芪甲苷含量）×0．5×100；综合评分＝干膏得率评分＋黄芪甲苷含量评分（见表2）。

采用Microsoft Excel进行分析，综合直观分析和方差分析判断各因素对提取效果的影响程度，筛选出在该试验条件下的优化提取参数（见表2）。根据正交试验结果可知，以干膏率和黄芪甲苷为评价指标，各因素的影响顺序为煎煮时间＞煎煮次数＞加水剂量，其中煎煮时间和煎煮次数对工艺有极显著影响（见表3），因此煎煮时间为1h，煎煮次数为3。而对于无显著影响的因素，只需结合具体工作及生产要求，本着尽量选择平均数最大的水平，最终确定为煎煮时间1h，加水量10倍，煎煮3次。

表2 正交试验

表3 方差分析

3 讨论

本试验对芪参口服液中黄芪甲苷的提取条件进行了考察，参考了《中国兽药典》2005年版2部［1］黄芪甲苷含量测定项下提取方法，将样品用水饱和正丁醇提取，分别用氨试液和蒸馏水洗涤，正丁醇蒸干后，比较了通过D101型大孔吸附树脂柱除杂的处理方法和省略使用大孔吸附树脂柱除杂的处理方法［7］。结果不经D101型大孔吸附树脂柱吸附洗脱的样品在黄芪甲苷保留时间处无杂质峰干扰，分离度好，而通过D101型大孔吸附树脂柱吸附洗脱的样品受试验操作影响较大，回收率较低。故本试验选用不经大孔吸附树脂柱除杂的处理方法。

目前，黄芪甲苷测定方法有薄层扫描法，但误差较大。又由于皂苷为一类具有极性，结构复杂的化合物，它只在紫外末端有吸收，若采用紫外检测末端吸收法（200～210nm）则有干扰峰，无法使用［5］。而蒸发光散射检测器为质量型检测器，不受外部环境干扰，试剂在检测器中全部蒸发，不干扰检测，灵敏度、稳定性及重现性均能符合含量测定的要求［6］。因此为提高芪参口服液工艺水平，可以采用蒸发光散射检测器测定黄芪甲苷的含量。

本试验选取黄芪药材有效成分黄芪甲苷的含量和干膏得率为优选正交试验方案的指标，采用高效液相色谱－蒸发光散射检测器测定黄芪甲苷的含量，确定了芪参口服液中黄芪水提的最佳条件为煎煮时间1h，加水量10倍，煎煮3次。

［1］ 中国兽药典委员会编．中华人民共和国兽药典（二部）［S］．北京：中国农业出版社，2005：312－313．

［2］ 高建，夏泉，黄建刚，等．HPLC－ELSD同时测定当归补血总苷中黄芪甲苷和黄芪皂苷II［J］．中成药，2012，34（2）：268－272．

［3］ 王红霞，王 蕾．HPLC－ELSD法测定利肝隆颗粒中黄芪甲苷的含量［J］．中国药房，2011，22（44）：4208－4209．

［4］ 吴青业，周恩丽，付小环，等．HPLC－ELSD法测定葛根口服液中黄芪甲苷［J］．中草药，2010，41（8）：1305－1306．

［5］ 易爱玲，周从辉，熊义涛．高效液相色谱－蒸发光散射检测器法测定补气养血口服液中黄芪甲苷的含量［J］．时珍国医国药，2008，19（6）：1407－1408．

［6］ 王欣，郭宏伟，张悫，等．HPLC－ELSD法测定阿胶黄芪口服液中黄芪甲苷的含量［J］．现代中西医结合杂志，2011，20（13）：1641－1642．

［7］ 谢委，方建国，杜光，等．高效液相色谱－蒸发光散射法测定扶正强筋片中黄芪甲苷含量［J］．医药导报，2012，31（2）：208－210．