拟康氏木霉胞外总多糖免疫活性研究

李丽华，喻丽珍，赵志刚，王国栋

（皖南医学院 药学系，安徽 芜湖 241002）

真菌多糖是自然界中存在种类较多、生物活性较高的一类活性多糖，是当今医药和食品工业共同关注的焦点[1].此类多糖具有很强的生物活性，主要集中在免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗突变、抗衰老、抗氧化等方面，在国际上被称为“生物反应调节剂[2]”.

拟康氏木霉（Trichoderma pseudokoningii）是从玉米秸秆中分离的一株木霉，属于真菌类半知菌亚门、丝胞纲、木霉属.拟康氏木霉胞外多糖（Extracellular polysaccharides of trichoderma pseudokoningii,TPeps）是采用液体发酵法，从拟康氏木霉中得到一类结构新颖的多糖.魏广金[3]从该多糖中分离得到两个组分TPeps-1和TPeps-2，并和郭敏等通过实验证明，这两个组分可提高番茄和黄瓜叶片水杨酸含量，激活植物的活性氧爆发使之产生诱导抗性及系统抗性，起到预先免疫的作用[4-6].孔梦丽[7]发现TPeps-1能增强小鼠的免疫功能，黄涛涛[8]的研究则表明[7]TPeps-1体外能显著促进巨噬细胞的吞噬活性，抑制白血病细胞K562的增殖.

上述文献说明拟康氏木霉胞外多糖的两个单一组分特别是TPeps-1体内外具有多种生物学活性，但有关该总多糖实验或报道则甚少或空缺，为了探索拟康氏木霉胞外总多糖是否具有良好的免疫活性，我们开展了本文中的实验研究.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

拟康氏木霉胞外总多糖（TPeps）：实验室自制；注射用环磷酰胺：江苏恒瑞医药股份有限公司；绵羊红细胞：芜湖市卫生防疫站.

1.2 实验动物

昆明种小鼠180只，雌雄各半，(20±2)g，购于南京江宁青龙山动物繁殖场.

1.3 方法

1.3.1 动物分组及给药方法

昆明种小鼠，按体重随机分成随机分成4组：模型组、TPeps低、中、高剂量组，每组12只.同时另取12只作正常对照组，其中模型组和正常对照组按20ml/kg体重的容积灌胃生理盐水，三个给药组分别按 50、100、200mg/(kg·d)剂量灌胃给药，每日1次，连续7天.

1.3.2 免疫低下动物模型的建立

除空白对照组外，上述各组小鼠均于第1、2、3天腹腔注射新配制的环磷酰胺70mg/kg，造成免疫低下动物模型.

1.3.3 对非特异性免疫功能的影响—碳粒廓清法[10]

上述五组小鼠末次给药后，立即给予20%的印度墨汁0.1m l/10g尾静脉注射，并分别于第2分钟及第10分钟后进行眼眶取血20μl，将所取眼眶血加入到盛有2ml的0.1%碳酸钠溶液试管中，于680nm处测其吸光度值.将小鼠处死，取其肝脏、脾脏并称重，根据以下公式计算脾脏指数和胸腺指数.

脏器指数＝脏器重量（mg）/小鼠体重（g）

1.3.4 对体液免疫功能的影响—血清溶血素法[11]

给予五组小鼠每日腹腔注射0.2ml的20%绵羊红细胞致敏.末次给药后1小时，对小鼠进行眼球取血，并分离血清.将50μl血清以生理盐水稀释500倍.取稀释后的血清1m l、5%的绵阳红细胞0.5m l及10%的豚鼠血清1m l放入试管混匀，置于37℃水浴保温10分钟，然后转移至冰浴中终止反应.以3000转速离心10分钟，取上清液1ml加入都氏试剂3m l，混匀后室温放置10分钟，于540nm处测定吸收值.另外取试验用的经过洗涤的5%绵羊红细胞0.25ml，加3.75m l都氏试剂，混匀后室温放置10分钟，540nm处比色，所得值即为绵羊红细胞半数溶血时的吸收度值.

样品的半数溶血值（HC50）=（样品的吸收度值/绵羊红细胞半数溶血时吸收度值）×500

1.3.5 对细胞免疫功能的影响—DTH法[11]

各组小鼠给药第3日同时致敏.腹部脱毛，在脱毛处涂于1%二硝基氟苯（DNFB）25μl，次日强化，致敏第4日右耳涂以DNFB 10μl进行攻击.24小时后将小鼠处死，用打孔器取下左右耳片，称重，以左右耳片之差表示DTH强度.

1.4 数据分析

数据均用SPSS软件分析，采用平均值±标准差表示，组间差异采用T检验.

2 结果与分析

2.1 对非特异性免疫功能的影响

实验结果显示，腹腔注射70mg/kg环磷酰胺能显著抑制小鼠的免疫功能，而TPeps50、100mg/kg剂量组能显著提高免疫低下小鼠的胸腺指数，其中100mg/kg剂量组还能提高脾指数，与模型组比较有统计学意义（P<0.01），表明TPeps具有增强非特异性免疫功能的作用.见表1.

表1 TPeps对免疫低下小鼠脏器指数的影响（)

表1 TPeps对免疫低下小鼠脏器指数的影响（)

与正常组比较 aP＜0.05，bP＜0.01；与模型组比较 cP＜0.01(以下同)

组别 动物数/n 剂量/（mg/kg·d） 胸腺指数/mg·g 脾指数/mg·g正常组 12 4.15±0.49 11.04±1.03模型组 10 1.34±0.54c 6.71±1.32c TPeps低剂量组 12 50 1.82±0.51a 7.15±1.28 TPeps中剂量组 11 100 1.91±0.39b 7.91±1.34a TPeps高剂量组 10 200 1.45±0.48 6.56±1.12

2.2 对体液免疫功能的影响

TPeps低、中剂量组可使免疫低下的小鼠溶血素水平呈显著回升趋势，与模型组比较差异显著（P<0.01），表明该多糖对体液免疫功能有增强作用.见表2.

表2 TPeps对免疫低下小鼠血清溶血素含量的影响()

表2 TPeps对免疫低下小鼠血清溶血素含量的影响()

/n 剂量/血清溶血素组别 动物数（mg/kg·d）/HC50正常组 12 511.3±50.9模型组 10 309.9±77.5c TPeps低剂量组 11 50 372.9±37.6a TPeps中剂量组 12 100 397.3±46.2b TPeps高剂量组 11 200 369.6±71.7

2.3 对细胞免疫功能的影响

结果显示，TPeps低、中剂量组可使免疫抑制的小鼠DTH反应升高，与模型组比较具有明显差异（P<0.05），表明该多糖具有增强细胞免疫功能的作用.见表3.

3 讨论

本文实验结果显示，拟康氏木霉胞外总多糖50～200μg/mL浓度能够有效刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖，但低浓度刺激并不明显.此外，动物实验显示该多糖低、中、高三个剂量组，其中50mg/kg和100mg/kg剂量组增强免疫功能的作用较强，而200mg/kg剂量组与模型组比较无统计学意义，这可能是因为随着剂量的加大，多糖的溶解度降低所致.

表3 TPeps对免疫低下小鼠迟发型过敏反应的影响(，n=10)

表3 TPeps对免疫低下小鼠迟发型过敏反应的影响(，n=10)

/（mg/kg·d） 耳壳重量/mg DTH组别 剂量 右 左 强度正常组 13.9±1.55 10.6±0.74 3.3±1.86模型组 11.7±1.53 10.5±1.17 1.14±1.24c TPeps 低剂量组 50 12.8±0.91 10.7±0.67 2.13±0.84a TPeps 中剂量组 100 12.4±0.69 10.1±0.57 2.26±0.89a TPeps 高剂量组 200 11.9±1.09 10.1±1.08 1.75±1.14

通过实验我们发现，拟康氏木霉胞外总多糖也有较好的增强免疫的功能，它在免疫方面的突出表现，也预示着其可能具有一定的抗肿瘤作用.此外，我们的前期实验也表明该多糖体外确实具有一定的抗癌活性.但有关该总多糖免疫活性的系统研究及与其单一组分的免疫活性比较，免疫活性和抗肿瘤作用之间的关系尚需进一步探索.

〔1〕欧阳天贽，李小定，荣建华.真菌多糖抗肿瘤及免疫调节作用研究进展[J].天然产物研究与开发，2006（18）：524-528.

〔2〕李慧玲，程玉鹏，蒋倩倩，等.药用真菌多糖抗肿瘤研究进展[J].黑龙江医药，2011，24（1）：118-121.

〔3〕魏广金.拟康氏木霉胞外多糖的分离纯化及其生物活性研究[D].济南：山东大学，2010.

〔4〕魏广金，相海英，陈靠山.拟康氏木霉胞外多糖的分离纯化及其对黄瓜幼苗活性氧的诱导[J].临沂师范学院学报，2009，1（3）:101-104.

〔5〕郭敏，柳春燕，陈靠山.拟康氏木霉胞壁多糖对黄瓜抗病性的诱导作用[J].天然产物研究与开发，2009，21(5)：748-751.

〔6〕郭敏，石磊，陈靠山.拟康氏木霉胞外多糖对番茄灰霉病的诱抗作用及对几种防御酶活性的影响[J].曲阜师范大学学报，2005，31（2）：99-102.

〔7〕孔梦丽.拟康氏木霉胞外多糖对小鼠的免疫增强活性研究[D].济南：山东大学，2011.

〔8〕Huang TT,Lin J,Cao JF,Zhang PY,et al.An exopolysaccharide from Trichodermap seudokoningii and its apoptotic activity on human leukemia K562 cells[J].Carbohydrate Polymers,2012,89(2):701–708.

〔9〕郝林华，牛德庆，陈靠山，等.拟康氏木霉液态发酵条件的研究[J].菌物学报，2005，24(2)：235-244.

〔10〕徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学（第二版）[M].北京：人民卫生出版社，1991.676，1226-1228.

〔11〕张骠，孔群，许惠琴，等.静安口服液治疗小儿多发性抽动症的药效研究[J].中国药师，2008，11(8):878-881.