川芎嗪逆转骨肉瘤（MG-63/ADM）细胞多药耐药的研究

何 宁 朱毅林 车国良

长沙市八医院骨科，湖南长沙 410002

1 研究背景

某些肿瘤细胞不单对原使用的药物产生耐药，同时对与之结构和作用机制完全不同的药物也会产生交叉耐药现象，这一现象被称为多药耐药（multidrugre sistance，MDR）[1]。国内外许多研究证实了肿瘤多药耐药是由P糖蛋白（P-gp170）介导，P-gp170为细胞膜表面的一种分子量约170KD的糖蛋白，细胞的抗药性是通过P170蛋白的作用而实现的[1]。因P170蛋白的药物外排泵作用，降低了细胞内药物的有效浓度，使肿瘤细胞逃逸了化疗药物的细胞毒作用，表现出抗药性。近年发现中药单体川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）具有钙离子阻滞作用，而钙离子阻滞剂多有化疗增敏，逆转肿瘤细胞多药耐药作用。本实验采用体外进行骨肉瘤耐药细胞（MG-63/ADM）的培养，观察川芎嗪及联用阿霉素在下调骨肉瘤耐药细胞（MG-63/ADM）中P-170蛋白的表达的作用。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 细胞系 人骨肉瘤（MG-63）细胞以及骨肉瘤（MG-63）耐药细胞系购于中南大学湘雅医学院细胞中心。

2.1.2 主要试剂和仪器 试剂：磷酸川芎嗪、阿霉素粉针、链霉素粉针和青霉素粉针、RPMI-1640液体培养基、胰蛋白酶、MTT粉FITC标记鼠抗人P-gp抗体。仪器：IX70倒置显微镜、Galaxys二氧化碳培养箱、LXJ-Ⅱ低速离心机、Centrifuge 5415高速离心机、电热恒温干燥箱、-20℃、4℃冰箱、超声波破碎仪、流式细胞仪FACSCalibur。

2.2 方法

2.2.1 细胞培养条件 人骨肉瘤（MG-630细胞以及骨肉瘤（MG-63）耐药细胞在37℃，5%CO2饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养。

2.2.2 MTT法测定骨肉瘤耐药细胞的耐药性 本实验MTT法是参照Scheltema的MTT法以及MTT法的影响因素的相关文献[2-3]，实验具体步骤如下：①取对数生长MG-63细胞，用0.25%胰酶分散细胞，吹打成细胞悬液，取适量细胞悬液染色后上细胞计数板进行记数，调整细胞悬液的浓度为3×104/mL，每孔180 μL细胞悬液植入96孔细胞培养板，置于37℃，100%湿度、含5%CO2实验条件的细胞培养箱内培养。②待96孔板内细胞贴壁后，分别设有7组：对照组（1组不加任何药物），实验组（2～7组）各组内药物组合以及药物浓度如表1所示。

表1 MTT实验各组内药物浓度

逆转耐药骨肉瘤细胞的川芎嗪的浓度的确定是根据相关文献，用 MTT法确定该药物对细胞生长率＞95%的药物浓度为非细胞毒性剂量[1]。用 MTT法检测川芎嗪对MG-63/ADM耐药细胞生长率＞95%的药物浓度为20 ng/mL以下。

③培养4～6 h后，给96孔板每孔加入MTT20μl（5 mg/mL），至MTT沉淀完全溶解，上酶标仪检测其分光光度值，测定570nm波长下吸光度值（OD值）取3孔OD值的平均数，实验重复3次。

用统计软件13.0计算出各组药物对细胞的相应的IC50值（药物杀伤细胞的50%的药物剂量）。用下式计算耐药细胞的耐药倍数[4]：耐药倍数=培养后的耐药细胞IC50值/培养前的细胞IC50值

2.2.3 流式细胞仪测定细胞P糖蛋白（P-gp）的表达 分别用含有2.5 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL和20 ng/mL的川芎嗪的RPMI-1640细胞液体培养基培养MG-63/ADM耐药细胞72 h后，以0.25%的胰酶消化后收集1×106个细胞。上流式细胞仪检测8～10×103个细胞，测定P糖蛋白（P-gp）的表达阳性率。每组检测3个平行标本，最终结果取三个结果的均值。本实验对照组为加药培养前的原始细胞，同样收集1×106个细胞，按照上述过程处理，但不用抗体标记。

2.3 统计学分析方法

运用SPSS 13.0软件包对实验数据进行统计学分析，主要包括：单因素方差分析、LSD-t检验、χ2检验等。均取P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 MG-63/ADM耐药细胞培养结果

MG-63/ADM耐药细胞可以在含0.29 ng/mL阿霉素（ADM）的1640液体培养基中生长。诱导培养的MG-63/ADM耐药细胞的耐药倍数是11.62。流式细胞仪测定MG-63/ADM耐药细胞的P糖蛋白（P-gp）表达是强阳性，表达率为69.86%。两种细胞相关参数比较见表2。

表2 不耐药MG-63和耐药细胞相关参数的比较

3.2 流式细胞检测骨肉瘤细胞的P170表达的结果

①不耐药骨肉瘤细胞P170表达（均数为10.55%）；②耐药骨肉瘤细胞P170表达（均数为69.86%）；③用2.5 ng/mL的川芎嗪处理耐药细胞后的P170表达（均数为60.26%）；④用5 ng/mL的川芎嗪处理耐药细胞后的P170表达（均数为55.07%）；⑤用10 ng/mL的川芎嗪处理耐药细胞后的P170表达（均数为46.85%）；⑥用20 ng/mL的川芎嗪处理耐药细胞后的P170表达（均数为36.2%）。

流式细胞仪检测经过或未经过TMP处理的骨肉瘤耐药细胞P170蛋白的表达率结果见以上。不耐药的骨肉瘤细胞P170蛋白的表达率为10.55%；而耐药的骨肉瘤细胞P170蛋白的表达率高达69.86%。

统计学分析，实验组和对照组之间比较，差异有统计学意义（P ＜ 0.05），各组P170表达率经过两两比较，差异均有显著的统计学意义（P ＜ 0.01）。本实验结果说明TMP对骨肉瘤耐药细胞的P170表达具有明显的下调作用。

4 讨论

许多肿瘤都有发生多药耐药的现象，虽然MDR的确切发生机制尚未完全阐明，但研究证实：P-170蛋白的过度表达是其主要机制之一[5]。因此，研制新的化疗增效剂，提高肿瘤对化疗的敏感性，特别是国外研究多药耐药的逆转剂或是耐药调节剂[6]，提高骨肉瘤肿瘤细胞对化疗药物的反应成了进一步改善骨肉瘤患者生存率的重要途径。

本实验非细胞毒浓度的川芎嗪与阿霉素联用在下调骨肉瘤耐药细胞（MG-63/ADM）的P-170蛋白表达的程度，从而探讨其逆转骨肉瘤耐药细胞耐药性的机制。

4.1 培养的骨肉瘤耐药细胞的耐药性

本实验中的MG-63/ADM耐药细胞的耐药倍数是11.62，同时流式细胞仪测定MG-63/ADM耐药细胞的P170（P-gp）表达是强阳性。应证了骨肉瘤耐药性和骨肉瘤的P170表达具有明显的相关性。

4.2 TMP对骨肉瘤耐药细胞的P170表达的下调作用

当川芎嗪的浓度从2.5 ng/mL，增加到5、10、20 ng/mL时，耐药细胞的P170相应地表达率为60.26%、55.07%、46.85%、36.2%。统计学分析表明，经过川芎嗪处理的细胞组和未经过川芎嗪处理的细胞组之间有统计学差异（P ＜ 0.05）。实验结果说明非细胞毒浓度的TMP对骨肉瘤耐药细胞的P170表达具有一定下调作用。

4.3 TMP对骨肉瘤耐药细胞的耐药性的逆转作用及其机制

本实验结果表明TMP对骨肉瘤耐药细胞的P170表达具有一定下调作用；由此可见，TMP对骨肉瘤耐药细胞的耐药性有部分逆转的作用，其机制之一是TMP可以下调肿瘤细胞膜上的P170蛋白的表达从而可能减少P170蛋白对ADM的外排作用，进而达到更好地杀伤骨肉瘤耐药细胞的效果；是否还有其它机制存在，还需要进一步研究。

总之，川芎嗪具有下调骨肉瘤MG-63/ADM耐药细胞的P-170蛋白的表达从而降低骨肉瘤细胞耐药性的作用。

[1] Min YD，Yang MC，Lee KH，et al.Protoberberine alkaloids and their reversal activity of P-gp expressed multidrug resistance（MDR）from the rhizome of Coptis japonica Makino[J].Arch Pharm Res，2006，29（9）：757-761.

[2] Loo T W，Bartlett MC，Clarke DM.Drug binding in human P-glycoprotein causes conformational changes in both nucleotide-binding domains[J].J Biol Che m，2003，278（50）：1575-1578.

[3] A WGATI QA.Regulation of ion channels by ABC transporters that secrete ATP[J].Science，1995，269（l）：805.

[4] Fuji H，Tanigawa N，Muraoda R，et al.Detection of P-g1ycoprotein by flow cytometry[J].Anticancer Res，1993，13：2171.

[5] Homicek FJ，Gebhardt Mc，Wolfe MW，et al.P-glycoprotein levels predict poor outcome in patients with osteosarcoma[J].J Clin Orthop，2000，373（1）：11-l7.

[6] Scotlandi K，Serra M，Nicoletti G，et al.Cancer Res，1996，56（10）：2434-2439.