何首乌饮对Leydig细胞衰老模型β-半乳糖苷酶表达的影响*

宋庆亮，郭 银，周 蕾，赵秀军，牛嗣云△

(1.河北大学基础医学院，河北保定 071000;2.河北医科大学)

随着人类预期寿命的延长，迟发性性腺功能减退症(late-onset hypogonadism,LOH)成为人们关注的热点[1]。LOH也称为中老年男性雄激素部分缺乏综合征(partial androgen deficiency of the aging male,PADAM)，是一种随老龄化血浆睾酮水平相对下降出现的一组临床综合征，主要表现是性功能障碍、情绪变化、睡眠欠佳、机体肌肉含量下降、疲乏、骨矿物质减少等[1-2]。机体内睾酮90%由睾丸Leydig细胞分泌。本研究采用H2O2和FeSO4损伤原代SD大鼠Leydig细胞建立Leydig细胞衰老模型，探讨何首乌饮对大鼠Leydig细胞衰老模型β-半乳糖苷酶表达的调节作用。

1 材料与方法

1.1 试剂 DMEM/F12(GIBCO)、胎牛血清，北京四季青生物试剂公司;β-半乳糖苷酶试剂盒，北京鼎国生物技术发展中心;胶原酶Ⅰ，美国Sigma公司。

1.2 何首乌饮含药血清的制备 何首乌饮方剂由何首乌、肉苁蓉、怀牛膝、淫羊霍、丹参、茯苓组成，各组分剪碎按质量比3:2:3:2:5:3比例混合，加8倍量蒸馏水浸泡1h，文火水煎2次，每次30min，合并滤液浓缩至每ml含生药4.8g。选用清洁级SD大鼠10只，雌雄不限(购自河北医科大学实验动物中心，许可证号:1112043)，体重300±20g。按0.4ml/100g灌胃给予大鼠何首乌饮，1次/d，连续7d，末次给药1h后，乙醚麻醉大鼠，颈动脉插管放血，分离血清。

1.3 细胞分组处理 出生10-20d幼年雄性SD大鼠，无菌取双侧睾丸，用胶原酶Ⅰ消化至生精小管分散，1500r/min离心15min，加等量的PBS清洗3次，4℃离心(1100r/min，7min)，弃上清，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液稀释细胞至1×106/ml，接种于96孔培养板中，37℃、5% CO2培养箱中培养。培养的Leydig细胞采用3β-HSD特异性染色进行鉴定[3]。正常组:Leydig细胞用DMEM/F12培养基培养128h;Leydig细胞衰老损伤组:Leydig细胞用DMEM/F12培养基原代培养48h后，加入50μmol/L的H2O2和100μmol/L的FeSO4培养8h，移去H2O2和FeSO4后，细胞在含10%胎牛血清的DMEM/F12中继续培养72h;何首乌饮预防组:用10%含药血清DMEM/F12培养基中原代培养Leydig细胞48h后，加入50μmol/L的H2O2和100μmol/L的FeSO4培养8h，移去H2O2和FeSO4后，继续在10%含药血清DMEM/F12培养基中培养72h;何首乌饮治疗组:Leydig细胞用DMEM/F12培养基原代培养48h后，加入50μmol/L的H2O2和100μmol/L的FeSO4培养8h，移去H2O2和FeSO4后，在10%含药血清DMEM/F12培养基中继续培养72h。

1.4 Leydig细胞β-半乳糖苷酶表达的检测 各实验组Leydig细胞原代培养并爬片，进行相应的处理后，用PBS漂洗两次，再用含2%多聚甲醛和0.2 %戊二醛的固定液4℃固定15min，用含1mol/L MgCl2的PBS漂洗两次，加入SA-β-gal染色液[1.2mM MgCl2,150mM NaCl,5mM K3Fe(CN)6,5mM K4Fe(CN)6,1mg/ml X-gal,100mM磷酸钠缓冲液，pH6.0]，37℃孵育48h。PBS漂洗终止反应，蓝染细胞为阳性细胞。×200倍显微镜随机选取视野，计数每10个细胞中的阳性细胞百分率，每张切片观察5个视野，每组观察3张切片，取平均值。

1.5 统计分析 采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，多组间资料的比较采用方差分析，两两比较采用S-N-K法。

2 结果

β-半乳糖苷酶定位在细胞质，阳性产物呈蓝色Leydig细胞衰老模型组β-半乳糖苷酶阳性细胞率明显高于正常组(P＜0.05);何首乌饮预防组、治疗组Leydig细胞β-半乳糖苷酶阳性细胞率明显低于模型组(P＜0.05);何首乌饮治疗组、预防组Leydig细胞β-半乳糖苷酶阳性细胞率比较，差异无统计学意义(P＞0.05)(见附表，附图)。

附表 各组Leydig细胞β-半乳糖苷酶阳性细胞率(±s)

附表 各组Leydig细胞β-半乳糖苷酶阳性细胞率(±s)

与衰老组比较:*P＜0.05

组别 β-半乳糖苷酶阳性细胞率(%)正常组 00.0±0.0*衰老模型组 98.3±2.8何首乌饮治疗组 68.6±4.3*何首乌饮预防组 70.7±2.2*

附图 各组Leydig细胞β-半乳糖苷酶的表达(×400)

3 讨论

Dimiri等1995年首次提出一种鉴定细胞衰老的标志酶—衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associate β-galactosidase,SA-β-Gal)，他们的研究发现，衰老成纤维细胞和角质形成细胞均表达此酶，而休眠细胞和终末分化细胞则缺乏。因此，目前将衰老相关β-半乳糖苷酶染色作为细胞衰老的生物学标志[4]。氧化损伤是目前建立细胞衰老模型常用的方法。H2O2属于反应性氧类，是细胞凋亡启动信号转导途径之一，可直接或间接诱导细胞凋亡;FeSO4参与机体氧化应激过程，可增加反应性氧的生成，诱导细胞凋亡。但同时加入H2O2与FeSO4后，细胞凋亡比例不但没有增加，反而明显降低，这是由于铁剂抑制了H2O2诱导细胞凋亡的作用，对细胞有保护作用，因此采用H2O2与FeSO4联合处理细胞，可使细胞处于衰老状态，而减少凋亡的发生[5-6]。

补肾中药何首乌饮由刘河间《宣明论方》何首乌丸加味而成，何首乌丸由何首乌、肉苁蓉、怀牛膝组成，具有补肝肾、益精血、延年益寿之功效，在此基础上加淫羊藿补肾壮阳以强筋骨、丹参活血化淤以通心脉、茯苓健脾利湿以宁心神。前期研究发现，何首乌饮具有抗氧化、调节血脂代谢紊乱和抑制卵巢、睾丸细胞凋亡的作用[7-10]。本研究进一步观察了何首乌饮对原代培养大鼠睾丸Leydig细胞衰老模型的调节作用。本研究发现，50μmol/L的H2O2和100μmol/L的FeSO4联合处理原代培养的Leydig细胞，可使Leydig细胞衰老标志性β-半乳糖苷酶的表达明显升高;何约能源首乌饮用药后可以明显逆转该现象，表明何首乌饮对H2O2和FeSO4引起的大鼠睾丸Leydig细胞衰老有一定的保护作用。

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