炭疽杆菌双重实时荧光PCR检测方法的建立

谭维国，陈文琦，吕 恒，刘 玉，王 平，陈凤娟，王长军，张锦海

(本文编辑:张仲书; 英文编辑:王建东)

炭疽杆菌能引起羊、牛、马等动物及人类的炭疽病，严重威胁公众财产、健康和生命安全，并且可形成气溶胶通过空气飞沫传播，易引发突发公共卫生事件，也常常被视为首选的生物恐怖/生物战病原［1-2］。目前的炭疽杆菌检测方法，主要基于对病原体的培养、染色镜检、血清学(抗原或抗体)检测等，但这些方法均不适合早期快速侦检，难以适应战时疫情控制的需要［3-4］。本研究选择了炭疽杆菌PX01质粒的保护性抗原PA基因、PX02质粒的荚膜合成相关基因capA基因作为检测靶基因，从而建立了一种双重实时荧光定量PCR的方法，能区分强毒株、弱毒株或无毒株，对于应对突发传染病疫情和流行病学调查、突发公共卫生事件应急处置的早期检测、及反生物恐怖袭击预警等具有重要的意义，并已应用在某次重大保障活动中。

1 材料与方法

1.1 材料 ①菌株和质粒:炭疽杆菌强毒株(军事医学科学院五所微检中心);大肠埃希菌XL10-Gold株(美国Stratagene公司);线性化质粒载体pGEM-T easy(美国Promega公司)。②主要试剂:DNA提取液(25 mM NaOH、10 mM Tris-HCl、1%Triton X-100、1%NP-40、0.1mM EDTA、2%Chelex-100)、Pyrobest Taq DNA聚合酶、DNA连接酶、DNAMarker DL2000、DNA纯化及片段回收、抽提质粒试剂盒、RNase H酶TliRNase H II、Taq DNA聚合酶Ex Taq HS等，均为TaKaRa公司(大连)产品;细菌DNA抽提试剂盒(北京天根公司)。③主要设备:ABI 7500 Fast型实时荧光定量 PCR仪(美国 ABI公司，配套软件SDS2.04)。

1.2 方法

1.2.1 引物、探针的设计 通过分别对NCBIGen-Bank中的炭疽杆菌的PA基因和capA基因序列，使用Beacon Designer等多种生物学软件，结合经验判断和人工比对、修正，进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的核苷酸区域，各设计一对引物和探针。设计原则为:引物间和引物内无互补序列，而且分别特异性地针对各靶基因，相互间无交叉反应，溶解温度(Tm值)相似，可在同一套反应体系中同时应用于检测和区分炭疽杆菌的PA和capA基因。

1.2.2 引物对及探针序列的合成 委托Takara(大连)公司合成，引物、探针序列和双标记的荧光基团见表1。

1.2.3 目标基因质粒标准品的制备 用细菌DNA抽提试剂盒按照说明书操作，从灭活的炭疽杆菌强毒株中提取基因组DNA。分别按表1的capA引物对序列、PA引物对序列，使用Pyrobest Taq DNA聚合酶对细菌基因组DNA进行PCR扩增，获得对应的capA基因片段、PA基因片段目标基因扩增产物，送交南京金斯瑞生物公司，拼接克隆至PGEM-T easy载体，经测序验证无误，称为 CapA-PA-PGEM质粒。将含CapA-PA-PGEM质粒的XL10-Gold细菌进行增菌，提取质粒DNA，用紫外分光光度计定量，利用阿伏加德罗常数公式(6.02×1023)×(ng/μl×10－9)/(DNA 长度 ×660)= 拷贝/μl计算拷贝数［5］，根据需要稀释分装，从而获得同时含有capA基因序列和PA基因序列的质粒标准品，置－20℃备用。

1.2.4 反应体系 反应总体积25μl，采用正交设计L16(45)考察 Mg2+、dNTPs、引物浓度、探针浓度、Ex Taq HS酶五因素，在四个水平上进行优化试验，最终确定的体系由以下组分构成:dNTP混合溶液(各2.5 mM)3 μl，MgCl2溶液(25 mM)5 μl，Tli RNase HⅡ(200 U/μl)0.5 μl，Ex Taq HS(5 U/μl)0.25 μl，10 ×Cycleave PCR Buffer 2.5 μl，PA、capA 引物对工作液(10μM)各1μl，PA探针工作液、capA探针工作液(均为5μM)各1μl，质粒标准品稀释液1μl或样本待测液4μl，最后以双蒸水补足至25μl。

1.2.5 反应参数 第一阶段:初期变性，95℃10 s;第二阶段:PCR反应，为95℃变性5 s，55℃退火10 s，然后72℃ 25 s延伸，并在此步骤监测荧光曲线;重复50个循环以更好地观察双重实时荧光扩增曲线的形状。判断阳性的标准是:循环阈值(Ct值)在38以内且扩增曲线呈S型。

1.2.6 灵敏度实验 将CapA-PA-PGEM质粒标准品作倍比连续稀释，使其拷贝数浓度从5×106拷贝/μl至 5 ×10－1拷贝/μl，然后加入反应体系内进行双重荧光PCR扩增，测定双重实时荧光PCR的灵敏度。

1.2.7 特异性实验 用建立的双重实时荧光PCR检测方法对课题组保存的炭疽杆菌强毒株核酸、鼠疫杆菌核酸、嗜肺军团菌1型、鼠伤寒沙门菌、山夫登堡沙门菌、福氏志贺菌、宋内志贺菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌标准株(ATCC 25922)、弗劳地枸橼酸杆菌、铜绿假单胞菌进行检测比较。

1.2.8 实战应用 在某次重大保障任务中，对解放军总后勤部卫生部提供的一次实毒实样(白色粉末)进行涂片革兰染色后发现背景杂乱，并见少许革兰阳性杆菌，随即对粉末样品用DNA抽提液按常规方法提取核酸，以本研究建立的双重实时荧光PCR方法进行检测分析。

表1 引物对及探针序列

2 结果

2.1 炭疽杆菌双重实时荧光定量PCR反应荧光曲线图 用本研究建立的方法，对炭疽杆菌强毒株核酸检测的荧光曲线见图1。

图1 炭疽的CapA基因、PA基因的双重实时荧光定量PCR扩增曲线

可见在单一反应孔中，同时成功检测出capA基因、PA基因，扩增曲线良好，呈典型的S型

2.2 灵敏度 经梯度稀释的CapA-PA-PGEM质粒标准品测试，本方法对capA基因、PA基因单检的灵敏度分别为每反应5和50拷贝，见表2。

表2 炭疽杆菌双重实时荧光定量PCR的检测灵敏度

2.3 特异性 应用本研究的双重实时荧光PCR方法，对保存的炭疽杆菌强毒株或核酸样品的检测结果均为阳性，而鼠疫杆菌、嗜肺军团菌1型、枯草芽孢杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌、大肠埃希菌标准株等形态相似杆菌、常见致病菌或条件致病菌的检测结果均为阴性。

2.4 实战应用 对解放军总后勤部卫生部提供的实毒实样，在严格生物安全防护条件下提取核酸后，应用本方法进行实战应用检测，结果阳性对照(质粒标准品)、阴性对照均确立，待测样品孔的荧光曲线图见图2。由图2可见待测样品所含的细菌capA基因检测阴性，PA基因检测阳性。考虑为capA基因缺失或已敲除的炭疽杆菌弱毒株(疫苗株)。经测序及上报检测结果后的反馈信息证实，检测结果完全正确。

图2 实毒样品的双重实时荧光定量PCR检测曲线

3 讨论

炭疽杆菌致病性与其PX01质粒上的保护性抗原基因(PA)和PX02质粒上的荚膜合成相关基因(capA)相关，如果只有其中一种质粒，即为弱毒株或无毒株［6-7］。在发生疫情和突发公共卫生事件中，因预警、控制及应急反应决策的需要，对于炭疽杆菌更需同时检测PA和capA，以区分是否存在炭疽杆菌并鉴定区分强毒株或弱毒、无毒株［8-9］。因此，建立一种炭疽杆菌的双重检测方法具有显著的针对性和实用性［10-11］。

本研究成功构建了同时含有炭疽杆菌capA基因片段、PA基因片段的重组质粒CapA-PA-PGEM，经测序正确，准确定量后，以此为标准品，建立了双重实时荧光定量PCR方法。由图1的荧光曲线可见，两个体系各自的特异性和工作性能良好，互相间无干扰;当capA基因为每反应5拷贝数、PA基因为每反应50拷贝数时，用本方法仍然能够检出。同时检测时FAM通道(capA)信号明显比JOE通道(PA)信号强，除引物探针性能外，也有可能是报告荧光的差异(目前FAM是使用最广泛和稳定的荧光基团)或基因表达丰度的问题，但并不影响实际应用［12］。对枯草芽孢杆菌、枸橼酸杆菌、鼠疫杆菌核酸、嗜肺军团菌、各型沙门菌、志贺菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等进行检测，均为阴性，本法特异性较好。除上述实验室考验外，本研究建立的方法还在实战中得到检验，在某重大保障活动中，对实毒实样(白色粉末)进行检测时准确鉴定出混入的少量炭疽杆菌弱毒株［13］。

本研究建立了能同时检测炭疽杆菌PA基因、capA基因的双重实时荧光 PCR的技术，在具有快速准确、高灵敏度的特点同时，可以实现一管多检，省时省力，极大地提高了检测速度和效率，对于应对突发传染病疫情及突发公共卫生事件应急处置的早期检测，反生物恐怖袭击预警等都具有重要的意义。

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