LY-294002对大鼠急性脊髓损伤后Bcl-2表达的影响

王岩峰 秦光华 杨明超 王 喆 (中国医科大学附属第一医院骨科，辽宁 沈阳 110001)

Bcl-2抑制细胞凋亡基因机制为:①抑制内质网Ca2+的释放;②Bcl-2阻止促凋亡基因信号传递或阻止诱导某些基因表达;③抑制自由基。潘磊等〔1〕对60只Wistar成年大鼠研究发现，实验组Bcl-2蛋白不仅在神经元中提高表达，更多在胶质细胞中表达，同时降低Bax的表达，BBB评分表明，神经细胞凋亡明显减少，大鼠神经功能恢复明显。国外有学者证实毫微粒MP疗法能减少副作用，增强急性脊髓损伤(SCI)功能恢复，其机制之一仍为提高 Bcl-2表达和抑制 Bax表达〔2〕，但是 LY-294002是否能够提高SCI大鼠脊髓损伤部位Bcl-2的表达尚不清楚。本实验参照Nystrom压迫方法制作大鼠脊髓压迫损伤模型，通过免疫组化和Western印迹方法检测不同时间点Bcl-2的表达情况，探讨PI3K/Akt信号通路在SCI的病理作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 羊抗大鼠Bcl-2多克隆抗体(Santa-Cruz，CA);PI3K阻断剂(LY-294002)，兔抗羊IgG、S-P免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒(福州迈新)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠SCI动物模型的建立及分组 取健康成熟SD大鼠104只，雌雄不限，体重220～250 g，由中国医科大学实验动物中心提供。随机分为:SCI组:脊髓损伤后分2 h，8 h，1 d，3 d，5 d，7 d共个6时间点，每个时间点8只;LY294002组:脊髓损伤前 0.5 h 尾静脉注射 LY-294002，分为 2 h，8 h，1 d，3 d，5 d，7 d共6个时间点，每个时间点8只，空白对照组8只，不做任何处理。模型制备:10%水合氯醛0.4 ml/100 g腹腔内注射，俯卧位固定，无菌原则下进行背正中切口，切除T8、T9椎板，暴露硬脊膜，整个过程保证硬脊膜的完整。按Nystrom法将35 g重物通过2.2 mm×5 mm弧形光滑金属垫片压迫该段脊髓后正中部5 min，分层缝合，碘伏消毒。损伤后，每天人工排尿(便)两次，局部消毒一次。

1.2.2 取材及切片制备 各组大鼠分别于脊髓损伤后各时间点取材，麻醉后剖胸，经左心室-主动脉插管，4%多聚甲醛灌流固定。以伤处为中心取1.5 cm脊髓组织，多聚甲醛浸泡固定。常规蜡块包埋，连续切片数张(纵切)，片厚6 μm。

1.2.3 免疫组化 每只大鼠取12张切片，按SP试剂盒说明书测定Bcl-2的表达，常规脱蜡至水，3%过氧化氢处理、高温修复、血清封闭、滴加一抗过夜(浓度为1∶150)，并同时用PBS代替一抗作为阴性对照，4℃孵育过夜、隔日滴加二抗孵育20 min、SABC 37℃孵育20 min，继而DAB显色，镜下观察显色背景。以上各步骤间均用0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min，梯度酒精逐级脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，光镜下观察脊髓组织变化。

1.2.4 Western印迹 动物以10%水合氯醛0.4 ml/100 g腹腔内注射，麻醉后，各时间点分别取4只动物，直视下取出距损伤中心区上下各0.5 cm两段脊髓，置于裂解液中机械匀浆，4℃ 17 000 r/min离心1 h，取上清，测蛋白浓度并计算加样量。制备12%分离胶，4%浓缩胶，用微量加样器将样品加在凝胶表面样品槽中。电泳后湿转至PVDF膜上。5%脱脂奶粉TTBS缓冲液4℃过夜。一抗Bcl-2、β-actin(1∶200)室温孵育2 h，洗膜，辣根酶标记羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000，Santa Cruz)室温孵育1 h，洗膜后加入ECL试剂(Santa Cruz)反应1 min，暗室曝光显影后冲洗胶片。凝胶成像分析系统上摄像分析，测得目标带的MOD，进而计算出各组样品Bcl-2目标带的MOD与内参照βactin MOD的比值。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件对数据进行统计分析，结果用±s表示，各组比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化结果 免疫组化结果发现，假手术组大鼠脊髓有大量的Bcl-2阳性表达的神经细胞(0.71±0.04);而在脊髓损伤后2 h时，Bcl-2阳性细胞数已开始明显减少，在3 d时Bcl-2阳性表达细胞数最少，5 d时Bcl-2阳性表达细胞数开始增加。在经LY-294002处理后的各时间点大鼠脊髓损伤部位的Bcl-2阳性细胞明显高于相同时间点的脊髓损伤组大鼠(P＜0.05)。显微图像分析统计光密度值是也得到了相同的结论，光密度值比较，见图1，表1。

2.2 Western印迹结果 从Western印迹电泳结果上可以看出，假手术组大鼠脊髓部位的Bcl-2的蛋白条带清晰(0.54±0.04)，而在脊髓损伤后2 h的Bcl-2的蛋白条带颜色已开始变浅变细，表达量开始减少，到3 d时，蛋白表达的条带最浅，5 d时表达开始逐渐增多，在经LY-294002处理后的各时间点大鼠脊髓损伤部位的Bcl-2蛋白表达则明显高于相同时间点的脊髓损伤组大鼠(P＜0.05)，见图2，表2。

表1 各组大鼠的Bcl-2蛋白的光密度值比较(± s，n=8)

表1 各组大鼠的Bcl-2蛋白的光密度值比较(± s，n=8)

与SCI组比较:1)P＜0.05，下表同

组别2 h 8 h 24 h 3 d 5 d 7 d SCI组 0.58±0.06 0.51±0.07 0.46±0.07 0.32±0.06 0.41±0.06 0.55±0.07 LY294002组 0.64±0.071) 0.56±0.071) 0.50±0.061) 0.42±0.061) 0.48±0.071) 0.61±0.071)

表2 各组大鼠的Bcl-2/β-actin的光密度值比较(± s，n=8)

表2 各组大鼠的Bcl-2/β-actin的光密度值比较(± s，n=8)

组别2 h 8 h 24 h 3 d 5 d 7 d SCI组 0.43±0.04 0.41±0.05 0.38±0.04 0.31±0.04 0.34±0.04 0.40±0.02 LY294002组 0.49±0.051) 0.46±0.041) 0.42±0.021) 0.40±0.021) 0.42±0.021) 0.43±0.021)

图1 免疫组化方法检测Bcl-2蛋白的表达(×400)

图2 Western印迹方法检测Bcl-2和β-actin蛋白的表达

3 讨论

SCI为临床常见的严重创伤，因高致残率和高病死率一直成为医学研究的热点。SCI包括原发性损伤和继发性损伤，原发性损伤不可逆，无法对其进行有效的治疗。继发性损伤是指伤后几小时至几天脊髓损伤局部原来正常的组织发生自身破坏性病变，其造成的损害超过原发性损伤〔3～5〕，研究证实，脊髓继发性损伤广泛存在着细胞凋亡现象〔6〕。

细胞凋亡受多种凋亡相关基因及其蛋白的调控，其中Bcl-2基因家族及其相关蛋白在细胞凋亡的调控过程中具有重要作用〔7〕，Bcl-2主要位于线粒体外膜、核被膜和内质网膜，可抑制细胞凋亡基因，有研究证实，β-七叶皂甙钠改善血循环，中止SCI继发性损伤，抑制脊髓神经细胞凋亡和炎症表达的机制之一是上调Bcl-2表达〔8〕，还有研究发现，银杏叶提取物(EGb)能抑制SCI后细胞凋亡，在运动功能恢复、损伤脊髓组织保护上发挥其有益作用，其机制之一也是上调Bcl-2和下调Bax基因表达〔9，10〕。磷脂酰肌醇(-3)激酶/蛋白激酶 B(PI3K/Akt)信号通路是体内非常重要的一个信号通路，能够调节细胞凋亡、葡萄糖代谢及蛋白质合成等过程。LY-294002是PI3K的特异性抑制剂，能够抑制PI3K的表达，阻断PI3K/Akt信号传导通路。但是，LY-294002是否能够通过阻断PI3K/Akt信号传导通路继而降低Bcl-2的表达参与脊髓损伤尚不清楚，这也是本实验研究的目的。本研究说明LY294002能够通过阻断PI3K/Akt信号传导通路继而降低Bcl-2的表达。

1 潘 磊，吕国华，雷 高，等.大剂量甲基强的松龙对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响〔J〕.郧阳医学院学报，2007;26(5):271-4.

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4 霍 岩，沈兆亮，王 冬，等.重组人促红细胞生成素对大鼠脊髓损伤后VEGF表达的影响〔J〕.解剖科学进展，2012;18(1):109-12.

5 霍 岩，沈兆亮，王 冬，等.重组人促红细胞生成素对大鼠脊髓损伤后NFκB表达的影响〔J〕.解剖科学进展，2012;18(2):70-3.

6 Bardeesy N，de Pinho RA.Pancreatic cancer biology and genetics〔J〕.Nat Rev Cancer，2002;12:897-909.

7 Rami A，Bechmann I，Stehle JH.Exploiting endogenous anti-apoptotic proteins for novel therapeutic strategies in cerebral ischemia〔J〕.Prog Neurobiol，2008;85(3):273-96.

8 王金光，郑启新，郭晓东，等.应用β-七叶皂甙钠治疗大鼠脊髓损伤的实验研究〔J〕.中国康复医学杂志，2005;2(1):15-7，80.

9 Ao Q，Sun XH，Wang AJ，et al.Protective effects of extract of Ginkgo biloba(EGb 761)on nerve cells after spinal cord injury in rats〔J〕.Spinal Cord，2006;44(11):662-7.

10 张 烽，冯炜炜，周海涛.银杏叶提取物对大鼠急性脊髓损伤后神经功能恢复的作用及其机制〔J〕.中国脊柱脊髓杂志，2007;17(9):675-9.