应用ITS序列对中药材红芪进行鉴定的有效性分析＊

魏妮娜，王晓明，牛宪立，姬可平

(遵义医学院珠海校区生物化学与细胞分子生物学教研室，广东珠海 519041)

红芪(Radix Hedysari)为豆科植物多序岩黄芪(Hedysarum polybotrys)的干燥根，为甘肃省道地中药材，在甘肃省分布较广，其中岷县最为出名［1］。中药材传统鉴定技术多采用新鲜植株材料，鉴定人员需具备一定的植物分类学知识和经验，市面上销售的红芪多为加工过的药材，其表面性状及显微特征均已发生变化，给鉴定工作带来很大的困难［3］。本文采用ITS序列对中药材红芪从分子水平进行鉴定，旨在探讨ITS条形码技术对中药材鉴定的有效性。

1 材料

1.1 供试材料 供试材料红芪由通讯作者购买于甘肃省定西地区岷县药材公司，并经甘肃中医学院中药鉴定教研室鉴定，凭证标本存放于遵义医学院珠海校区生物化学与细胞分子生物学教研室。

1.2 试验试剂 三羟甲基氨基甲烷(Tris)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、乙二胺四乙酸(EDTA)、醋酸钠、硼酸，购于天津大茂化学试剂厂;Tris－饱和酚、氯仿、异戊醇、浓HCl、异丙醇、无水乙醇，购于广州番禺力强化工厂;琼脂糖、GoldView TM购于庄萌生物;高保真即用型PCR试剂盒、RNase，购于上海生物工程技术服务有限公司;ITS序列扩增引物合成于北京六合华大基因科技股份有限公司。

1.3 试验仪器 液氮罐(东亚液氮罐YDS系列)、高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)、恒温水浴箱(北京长源实验设备厂)、高速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)、DYCP－31DN型琼脂糖水平电泳仪(北京六一仪器厂)、EDC－810型基因扩增仪(东胜创新生物科技有限公司)、WD－9413B型凝胶成像分析系统(北京六一仪器厂)。

2 方法

2.1 总DNA的提取 采用改良的CTAB法提取靶植物的总 DNA［4］。

2.2 PCR扩增 采用ITS序列的通用引物P1:5’－ATGTCACCACAAACAGAAAC －3’，P2:5’－TCGCATGTACCTGCAGTAGC－3’。采用引物 P1和引物P2对供试品的ITS序列进行扩增。在25(l反应体系中，含模板 DNA1(l、引物各 1.0(l、ddH2O10(l、2 × PCR Master13(l。扩增:92 ℃ 预变性5 min;92℃变性40 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环;72℃延伸5 min。

2.3 测序 用1.0%琼脂糖凝胶对PCR扩增产物初步鉴定后，将符合测序要求的样品送往北京六合华大基因科技股份有限公司(广州分公司)进行双向测序;应用CodonCode Aligner软件将测序峰图剪切拼接，获得高质量ITS序列。

2.4 登录GenBank核苷酸数据库 将ITS序列进行BLAST相似性搜索，确定是否是该物种的同属或者同科植物，并将所得序列提交到GeneBank，获得登录号。

2.5 序列对比分析 将样品的ITS序列与NCBI核酸数据库中已有的红芪、黄芪 ITS序列应用MEGE5.1进行序列对比，计算遗传距离并构建系统发育邻接树。

3 结果

3.1 测序结果及序列分析 将双向测序所得序列峰图应用CodonCode Aligner软件将测序峰图剪切拼接，获得高质量ITS序列(见图1)。

图1 红芪ITS碱基序列

将红芪ITS序列提交到NCBI利用BLAST进行相似性搜索，查看前十个搜索结果(见表1)。将红芪ITS序列提交给 NCBI，获得登录号KF032294。

3.2 碱基变异位点分析 将中药材红芪的ITS序列与NCBI核酸数据库里已有的多序岩黄芪(Hedysarum polybotrys)、太白岩黄芪(Hedysarum vicioides)、锡金岩黄芪(Hedysarum sikkimense)、黄芪(Astragalusmembranaceus)ITS序列应用MEGE5.1进行序列对比，分析结果(见图2)。

表1 Blast相似度搜索结果

从图3中可看出，中药材红芪与多序岩黄芪、太白岩黄芪的ITS序列之间有5个变异位点，分别为129位点的A－G变异，157位点G缺失，264位点的A－C、559位点的T－C和676位点T插入。中药材红芪与锡金岩黄芪的ITS序列之间有12个变异位点，而中药材红芪与黄芪的ITS序列之间有102个变异位点。

3.3 遗传距离分析 将中药材红芪、多序岩黄芪、太白岩黄芪、锡金岩黄芪、黄芪的ITS序列进行分析，根据碱基变异位点的情况，应用MEGA5.1软件计算出物种间的遗传距离(见表2)。

图2 ITS序列的变异位点

表2 两两样品之间的遗传距离

由表3可得出，红芪、多序岩黄芪与太白岩黄芪这三个物种的K－2P距离在0.000到0.004之间，红芪与锡金岩黄芪的K－2P距离为0.018，而红芪与黄芪的K－2P距离为0.153。

3.4 系统发育邻接树分析 从基于ITS条形码序列构建的红芪与其近缘物种的NJ树(见图3)可以看出，红芪、多序岩黄芪与太白岩黄芪聚为一支，后又与同属植物锡金岩黄芪聚为一支。而黄芪独立为一支。从NJ树图可以看出红芪与黄芪能明显区分开。

图3 红芪与近缘物种ITS序列的系统发育树

4 讨论

据调查市面上出售的红芪价格高于黄芪，两者的价格差异主要是因采挖的方式不同，红芪生长在灌木丛中，黄芪是人工规模化种植，但加工后红芪和黄芪的形状是相同的。红芪作为黄芪的近缘植物，在我国西北、西南、港澳台及东南亚地区仍有将红芪和黄芪互为替代品的使用习惯，在港澳及东南亚等地更有认为红芪的药用价值大于黄芪。

近年来植物DNA条形码的研究异常火热，焦点集中在对植物DNA条形码候选片段的分析筛选实验和整体评价。然而这项技术尚在研究阶段，迄今为止，在陆生植物中还没有找到理想并具通用性的 DNA 条形码［5－10］。

本实验提取经形态学鉴定的中药材红芪总DNA，扩增ITS序列进行双向测序，以保证ITS序列的完整性;红芪的ITS序列总长为680bp，CG含量占54.6%。其中ITS1长299bp，CG含量占57.9%;5.8S 长 161bp，CG 含量占 50.4%;ITS2 长220bp，CG含量占58.6%。将红芪ITS序列提交到NCBI利用BLAST进行相似性搜索。查看前十个搜索结果(见表1)，结果显示与所检测序列所属的植物属于同属或同科植物，证明测序准确。中药材红芪ITS序列与其NCBI核酸数据库中已有的多序岩黄芪和同属植物太白岩黄芪的ITS序列几乎完全一致，而与近缘物种黄芪变异较大，故ITS序列可有效区分红芪与其近缘物种黄芪。因此，ITS条形码技术对加工后的中药材鉴定有效性提供了依据。

［1］杨林，谭玉玲.中药红芪研究现状［J］.中外医疗，2010，15(5):120－121.

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［3］袁毅君，王廷璞，李蕊，等.甘肃道地药材红芪的质量控制研究进展［J］.天水师范学院学报，2010，30(5):43－46.

［4］王晓明，姬可平，牛宪立，等.matK序列作为DNA条形码在中药鸡骨草中的应用［J］.广东农业科学，2012，39(2):132－134.

［5］李丹丹，郭水良，于晶，等.基于4个叶绿体基因识别蓑藓属(Macromitrium)植物的可行性研究［J］.植物科学学报，2013，31(1):23 －33.

［6］王晓明，姬可平，牛宪立，等.DNA条形码与动植物分类学的研究［J］.生物信息学，2012，10(2):1672 －5565.

［7］Hou Dianyun，Song Jingyuan.Molecular identification of Corni Fructus and its adulterants by ITS/ITS2 sequences［J］.Chinese Journal of Natural Medicines，2013，11(2):0121－0127.

［8］陈士林，姚辉，韩建萍，等，中药材DNA条形码分子鉴定指导原则［J］.中国中药杂志，2013，38(2):141－148.

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［10］袁庆军，张文婧，姜丹，等.论中药分子鉴定的方法和原则［J］.植物分类与资源学报，2012，34(6):607－613.