SiRNA沉默HBx表达对HepG 2.2.15细胞增殖和凋亡的影响

孙越鹏，耿 磊，李长福，范 芳

(1.天津生物工程职业技术学院，天津 300462;2.天津药业研究院有限公司，天津 300000；3.遵义医学院 生物化学教研室，贵州 遵义 563099)

SiRNA沉默HBx表达对HepG 2.2.15细胞增殖和凋亡的影响

孙越鹏1，耿 磊2，李长福3，范 芳3

(1.天津生物工程职业技术学院，天津 300462;2.天津药业研究院有限公司，天津 300000；3.遵义医学院 生物化学教研室，贵州 遵义 563099)

目的观察沉默HB x基因表达对肝癌细胞HepG2.2.15增殖和凋亡的影响。方法用脂质体转染法将pSIHBV/X转染肝癌细胞HepG2.2.15，RT-PCR法检测HBx mRNA表达；ELISA法检测细胞上清液中HBsAb和HBeAg的表达情况；MTT法检测对细胞增殖的影响；AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况。结果pSIHBV/X质粒转染HepG2.2.15细胞后HBx mRNA表达较对照组明显降低(P<0.01)；G2.2.15细胞上清液中HBsAg和HBeAg的水平下降，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；MTT法检测结果显示转染pSIHBV/X质粒后HepG2.2.15细胞的增殖受到抑制，AnnexinV-FITC/PI双染法检测结果显示HBx siRNA可促进细胞凋亡，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论靶向HBx基因的干扰质粒能降低HepG2.2.15细胞中HBsAg和HBeAg的水平、抑制HepG2.2.15细胞增殖，促进HepG2.2.15细胞凋亡。

RNA干扰；HBx基因；HepG2.2.15细胞；增殖；凋亡

肝细胞癌( hepatocellular carcinoma， HCC) 是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发生是一个多阶段的病理学过程。我国是乙型肝炎的高发区，绝大部分肝癌患者存在过乙型肝炎病毒( heptis B virus，HBV)的感染，HBV是HCC的致病因子已得到公认，HBV x基因编码的HBV X蛋白与肝癌的发生密切相关，可通过反式激活作用干扰宿主细胞的增殖、调节细胞周期及凋亡[1-2]。HepG2.2.15细胞是含有HBV基因的肝癌细胞，是研究HBV的细胞模型系统[3]。本实验应用RNA干扰技术沉默HBx基因，观察抑制HBx基因表达对HepG2.2.15细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂 肝癌细胞株HepG2.2.15购自博慧斯生物技术公司；pSIHBV/X与对照质粒pTZU+1由泸州医学院张建军教授惠赠；质粒扩增菌种DH5α、内切酶等购于宝生物有限公司；DMEM高糖培养基、胰蛋白酶为美国GIBCO产品；胎牛血清购于Hyclone公司；Lipofectamine2000为Invetrogen公司产品；ELISA试剂盒购自华美生物工程公司；AnnexinV-FITC/PI双染试剂购自与Sigma公司。

1.2 实验分组及质粒转染 实验共分4组：以未转染的细胞作为空白对照组(control group)；仅加脂质体的细胞作为脂质体组(LipofectamineTM2000 group)；以转染阴性对照质粒细胞作为质粒对照组(control plasmid group)；以转染pSIHBV/X质粒细胞作为pSIHBV/X实验组(pSIHBV/X group)。利用脂质体LipofectamineTM2000将pTZU+1与pSIHBV/X质粒转入细胞(操作步骤同说明书)：选取对数生长期细胞，待细胞融合度为80%时进行转染，6 h后更换正常培养基培养，继续培养24 h、48 h、72 h。

1.3 RT-PCR检测HBx基因的表达 RT-PCR分析转染后24 h各组细胞HBx基因的表达情况，使用HBx引物为：上游5′-TCATCGCCAGCATCATCAAAC-3′，下游3′-ATGTACGGCTGGAGGTCTGTCA-5′，扩增长度为463 bp。用RNA抽提试剂盒分别提取每组细胞总RNA，按试剂盒说明书进行RT反应，以10 μL RT产物为模板，分别扩增β-actin和HBx基因片段。扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，将结果用凝胶成像系统扫描灰度值，以各组目的基因与内参的灰度比值作为相对表达量，比较各组之间的差异。

1.4 ELISA法检测HBsAb和HBeAg的表达 将pSIHBV/X质粒转染HepG2.2.15细胞，收集转染前后细胞培养液，采用HBsAb和HBeAg诊断试剂盒及ELISA方法检测HBsAb和HBeAg的表达情况，计算抑制率。抑制率=(1-实验孔OD值/空白对照孔OD值)×100%。

1.5 MTT法检测各组细胞的增殖 取对数生长期细胞接种于96孔板中，每孔接种1×104个。培养12 h后，洗掉培养液，换1%胎牛血清的低血清培养基同步化12 h。依实验分组进行细胞转染，放入CO2培养箱中培养。时间到后，洗掉培养液，加入不含胎牛血清的培养基100 μL，、50 μLMTT溶液，继续培养4h后，酶标仪492 nm波长处测定各孔吸光度值，计算转染24 h、48 h、72 h后细胞增殖情况。

1.6 AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡 取对数生长期细胞，用含10 %胎牛血清的DMEM培养液接种于铺有盖玻片的24孔板中，每孔接种2×104个。培养12 h后，按照脂质体转染法进行转染。取800 μL的Binding Buffer加入8 μL AnnexinV-FITC和8 μL Propidium Iodide(PI)，避光，室温反应5 min。高倍镜下随即取5个视野，在荧光显微镜下观察拍照并计算平均凋亡指数(凋亡指数 = 每高倍视野凋亡细胞数/每高倍视野细胞总数×100 %)。

2 结果

2.1 质粒pSIHBV/X酶切、测序

2.1.1 质粒pSIHBV/X酶切结果 pSIHBV/X为氨苄抗性质粒，经转化DH5α后，对从阳性菌落中扩增提取的质粒pSIHBV/X进行酶切，1和2泳道显示pSIHBV/ X表达载体未被酶切和经Sal Ⅰ酶切后，大小基本相等，泳道3显示经Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切后重组体质粒产生2800bp、395 bp 左右的两个条带，泳道4经Xba Ⅰ酶切成约3100bp 的DNA 片段，证实重组表达质粒pSIHBV/ X构建正确(见图1)。

注：M:DL5000 marker;1：pSIHBV/X表达载体未被酶切;2: pSIHBV/ X表达载体经Sal Ⅰ酶切;3：pSIHBV/ X表达载体经Hind Ⅲ和EcoRⅠ双酶切;4：pSIHBV/ X表达载体经Xba Ⅰ酶切质粒pSIHBV/X测序结果。 图1 质粒pSIHBV/X酶切鉴定

2.1.2 质粒pSIHBV/X测序结果 将质粒送到生工测序，引物为U6启动子的通用引物，测序结果显示siRNA的表达模板5′-TCGAGGAACCAACAAGAAGATGAGTTCGCTCATCTTCTTGTTGGTTCT

TTTT-3′成功插入了载体中。证实特异表达载体pSIHBV/X构建正确。pSIHBV/X质粒插入测序结果(下划线为小干扰RNA的作用靶点)：GCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTCGA

GGAACCAACAAGAAGATGAGTTCGCTCATCTTCT

TGTTGGTTCTTTTTCTAGAGCGGACTTCGGTC.

2.2 RT-PCR检测HepG2.2.15细胞HBx基因的表达 RT-PCR检测结果(见图2、表1)，pSIHBV/X组HBx表达量低于其它各组，差异有统计学意义(P<0.01)，抑制率为53.6%。而其它各组表达量差异无统计学意义(P>0.05)。

注：1：空白对照组 2：脂质体组3：空载体组4：pSIHBV/X组。 图2 HBx基因在HepG2.2.15细胞中24h的表达

表1 HBx在HepG2.2.15细胞中的表达(24 h)

组别HBx/β-actin(x±s)空白对照组1．615±0．148脂质体组1．543±0．134pTZU+1空载体组1．669±0．108pSIHBV/X实验组0．750±0．075∗∗

注：**：与空白对照组比较，P<0.01。

2.3 pSIHBV/对各组细胞中HBsAb和HBeAg的抑制作用 ELISA检测结果显示(见表2，表3)：在转染24 h和48 h后pSIHBV/ X 组细胞培养上清液中HBsAg 和HBeAg 的表达量都有明显下降(P<0.01), 空白对照组、脂质体组、空载体组差异无显著性(P>0.05)。

组别OD450(x±s)24h48h空白对照组0．875±0．0791．550±0．185脂质体组0．861±0．2241．701±0．076pTZU+1空载体组0．842±0．0271．635±0．145pSIHBV/X实验组0．466±0．011∗∗0．630±0．877∗∗

注：**：与空白对照组比较，P<0.01。

组别OD450(x±s)24h48h空白对照组0．218±0．1250．365±0．128脂质体组0．244±0．0590．447±0．119pTZU+1空载体组0．208±0．0420．341±0．157pSIHBV/X实验组0．134±0．011∗∗0．217±0．025∗∗

注：**：与空白对照组比较，P<0.01。

2.4 MTT法检测各组细胞的增殖 MTT法结果显示：空白组24 h、48 h、72 h OD490的吸收值分别为0.436±0.027、0.731±0.017、1.105±0.051，而pSIHBV/X组24 h、48 h、72 h OD490的吸收值分别为0.388±0.087*、0.623±0.016*、0.997±0.036*(P<0.05)。从图3可看出pSIHBV/X组在转染后24h、48h、72h都对细胞生长具有抑制作用，且48 h抑制效果最明显。

图3 MTT法检测各组细胞增殖情况

2.5 AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡 pSIHBV/X组在24h和48h细胞凋亡数量明显高于其它各组，凋亡率分别为25.66%和34.14%(P< 0. 01)。空白对照组、脂质体组、pSIHBV/X组差异无统计学意义(P>0.05，见表4)。

表4各组24 h和48 h细胞凋亡指数

组别总视野数24h凋亡指数(x±s)48h凋亡指数(x±s)空白对照组517．13%±0．19%24．09%±1．22%脂质体组519．60%±0．27%25．06%±1．03%pTZU+1空载体组519．32%±4．47%25．65%±0．12%pSIHBV/X实验组525．66%±1．86%∗34．14%±1．05%∗

注：*：与空白对照组比较，P<0.05。

3 讨论

乙肝病毒的感染是肝脏疾病(包括肝炎，肝硬化和肝癌)发生的主要原因，[4]。HBV x基因是HBV病毒基因组中最小的开放性读码框，是HBV复制的关键性基因，HBx蛋白在调节基因转录、细胞增殖及凋亡中均具有很强的活性，研究发现 HBx蛋白在肝癌的发生发展中起了非常重要的作用[5-6]。

HBx基因可通过激活癌基因与细胞因子基因启动子而调节细胞的生长、分化。将HBx基因导入小鼠成纤维细胞NIH3T3中，然后用地塞米松诱导，结果发现细胞DNA合成增加、细胞周期进程加快。研究发现，HBx基因转染HepG2细胞后，细胞生长力旺盛、分裂相多见，克隆形成率高于空载体组和未转染组细胞。对肝癌细胞周期的检测也发现，HBx基因转染的HepG2细胞，其G0/G1期细胞比空载体组和未转染组减少而进入S期的细胞比例增高，提示HBx基因转染加快了肝癌细胞周期进程，促进肝癌细胞生长，使肝癌细胞恶性程度增高[7-10]。

HepG2.2.15细胞被广泛用于HBV病毒的检测试验，为了研究pSIHBV/X表达载体能否有效的抑制HBV的复制和表达，进一步的证实抑制效应，本研究检测了pSIHBV/X对细胞上清液中HBsAg和HBeAg表达的抑制作用。研究发现转染pSIHBV/X干扰质粒于HepG2.2.15细胞沉默HBx基因后HBx mRNA水平表达显著降低，细胞培养上清液中HBsAg 和HBeAg 的表达量与对照组相比明显下降(P<0.01)。pSIHBV/X对HepG2.2.15细胞增殖有明显抑制作用，抑制率明显高于空白对照组、空载体组、脂质体组(P<0.01)。结果显示在转染后48h抑制效果最佳，72 h抑制效率下降，其可能原因是siRNA的表达载体随着细胞的快速分裂而不断的丢失，从而降低了干扰效率。

目前关于HBx引发的凋亡信号通路越来越受到研究者的关注，但无统一的定论。许多研究已表明，HBX蛋白对细胞的凋亡有着双层作用。一方面，HBX蛋白可以阻断凋亡，另一方面却起着促凋亡作用。HBX蛋白对细胞凋亡的双层作用显示了x基因的表达及其在病毒发病原理中的生理作用是复杂多样的，而且可能是紧紧相互协调的。HBx可通过抑制p53的表达、提高细胞内Ca2+浓度、促进survivin的表达等抑制肝癌细胞的凋亡。BcL-2为抑凋亡蛋白，Bax为促凋亡蛋白。研究发现HBx均能使上述基因高表达，从而证实了HBx既能促进细胞的凋亡又能抑制细胞的凋亡[11-12]。HBx还能通过抑制线粒体膜去极化抑制凋亡[13]。HBx还可以通过氧化应激反应磷酸化Raf-1的ser338/339和Tyr340/341位点，激活Raf-1移位至线粒体使细胞免受应激所引起的凋亡[14-15]。c-myc癌基因既能促进细胞增殖能力又能促进细胞的凋亡能力，c-myc所在HBx瞬时转染的HepG2细胞和HepG2.2.15细胞中表达量相比较，前者要远远高于后者[16]。提示了急性感染HBx的HepG2细胞对增殖和凋亡更加敏感。本实验结果显示HBx siRNA对HepG2.2.15细胞的凋亡有促进作用。原因可能是实验所用肝癌细胞中更多的启动了凋亡相关基因和蛋白的表达。目前为止，HBV感染对肝癌细胞凋亡的调节作用和确切机制尚不清楚，还有待进一步实验研究。

[1] 冯华, 吴丹, 金晓明.HBV对肝癌细胞系HepG2和HepG2.2.15中MMP-2及MMP-9的表达影响[J].医学综述，2012，18(15)：2483-2485.

[2]Zhang X，Zhang H，Ye L．Effects of hepatitis B virus X protein on the development of liver cancer[J].Lab Clin Med,2006,147(2):58- 66.

[3]Sells M A, Chen M L, Acs G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA[J]. Proc Nati Acad Sci USA，1987,84(4):1005-1009.

[4]Kim K H.Pro-apoptotic function of hepatitis B virus X protein[J].Korean J Hepatol，2010,16(2):112-122.

[5]Feng H，Li X，Niu D，et al.HBx expression activates RhoA GTPase: impact on cell migration[J].Cell Biol Int，2011,35( 2):159- 164.

[6]Lakhtakia R, Kumar V, Reddi H，et al.Hepatocellular carcinoma in a hepatitis mouse model：A sequential pathological valuation research[J].Gastroenterol Hepatol,2005，18(1) :80-9l.

[7]孙爱武，陈园生. 乙型病毒性肝炎和原发性肝细胞癌[J].中国疫苗和免疫，2010,16(2)：173-177.

[8]Ying R S, Zhu C, Fan X G, et al.Heptatitis Bvirus is inhibited by RNA interference in cell culture and in mice[J].Antiviral Res,2007,73(1):24-30.

[9]McClune A C, Tong M J.Chronic Hepatitis B and Hepatocellular Carcinoma[J].Clin Liver Dis，2010,14(3):461-476.

[10]李卫华,缪晓辉，戚中田，等.乙型肝炎病毒X蛋白对肝癌细胞生长的影响[J].生物医学工程与临床，2008，12(3)：235-238.

[11]Diao J,Khine A A，Sarangi F，et al.X protein of hepatitis B virus inhibits Fas-mediated apoptosis and is associated with up-regulation of the SAPK/JNK pathway[J].J Biol Chem,2001,276(11):8328-8340.

[12]Tong G D, Zhou D Q, Feitelson M,et al.Preneoplastic markers of hepatitisB virus-associated hepatocellular carcinoma and their significance inclinical settings[J].Chin J Hepatol，2007,15(11):829-833.

[13]Yang J Q, Pan G D, Chu G P，et al.Interferon-alpha restrains growth and invasive potential of hepatocellular carcinoma induced by hepatitis B virus X protein [J].World Gastroentero，2008,14(36):5564-5569.

[14]Ou D P, Tao Y M, Tang F Q,et al.The hepatitis B virus X protein promotes hepatocellular carcinoma metastasis by upregulation of matrix metalloproteinases[J].Int J Cancer,2007,120(6):1208-1214.

[15]Lian Z, Liu J, Wu M, et al.Hepatitis B x antigen up-regulates vascular endothelial growth factor receptor3 in hepatocarcinogenesis[J].Hepatology,2007,45(6):1390-1399.

[16]Yang L, He J, Chen L,et al.Hepatitis B virus X protein upregulates expression of SMYD3 and C-MYC in HepG2 cells[J].Med Oncol，2009，26(4):445-451.

[收稿2013-05-02;修回2013-06-10]

(编辑：谭秀荣)

TheeffectsofsilencingofHBxgeneexpressionbysiRNAontheproliferationandapoptosisofHepG2.2.15cells

Sunyuepeng1,Genglei2,Lichangfu3,Fanfang3

(1.Tianjin Vocational College of Bioengineering, Tianjin 300462,China;2.Tianjin Pharmaceutical Research Institute Company Limited，Tianjin 300000,China；3.Department of Biochemistry,Zunyi Medical University，Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveObserve the effects of silencing HBx gene expression on the proliferation and apoptosis of HepG2.2.15 cells.MethodspSIHBV/X siRNA interference vectors were transfected into HepG2.2.15 cells．The HBx mRNA expression was measured using RT- PCR. The levels of HBsAg and HBeAg in cell supernatant were determined by ELISA. The cell proliferation was evaluated by MTT. The cell apoptosis was detected by Annexin V-FITC/PI double staining method.ResultsAfter transfection of the pSIHBV/X siRNA vectors，HBx mRNA expression was inhibited compared with control group(P<0.01)；The levels of both HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cell supernatants were significantly decreased after the transfection of pSIHBV/X, compared with the control group (P<0.01). The cell proliferation was inhibited and the cell apoptosis was promoted after the transfection of pSIHBV/X, compared with the control group (P<0.01).ConclusionOur results display that HBx gene RNA interference resulted in the reduction of the levels of HBsAg and HBeAg, the inhibition of cell proliferation and the increase of cell apoptosis in HepG2.2.15 cells.

RNA interference; HBx gene; HepG2.2.15；proliferation; apoptosis

R735.7

A

1000-2715(2013)04-0301-05

遵义医学院硕士启动基金资助项目(NO:2004018)。

范芳,女,副教授,硕士生导师,研究方向：肿瘤分子生物学，E-mail:fanf1970@126.com。