利谷隆致雄性子代大鼠睾丸毒性的基因差异表达＊

白建伟，李 岩

(遵义医学院公共卫生学院，贵州遵义 563099)

利谷隆(Linuron，LIN)即1－甲氧基－1－甲基－3－(3，4－二氯苯基)脲，是一种取代脲类低毒农药除草剂，对一年生禾本科杂草，如马唐、狗尾草有很好的防除效果。由于LIN具有无致畸、致癌和诱变效应且组织残留少，副作用小等优点，被广泛应用于粮食及果树的种植中。然而近期研究发现LIN具有抗雄激素样作用，与雄激素竞争细胞表面雄激素受体(androgen receptor，AR)，干扰受体细胞内雄激素信号转导而抑制雄激素生物学功能［1］。此外，还有研究发现LIN的抗雄性激素样作用主要通过LIN的中间代谢产物3，4－二氯苯胺竞争性结合AR抑制睾酮的合成而实现的［2］。研究结果表明LIN具有生殖毒性作用［3］。

目前有关具有抗雄激素样作用除草剂的生殖毒性报道，多是对亲代SD大鼠生殖器官及激素水平上表征其雄性生殖毒性的研究，如李岩等发现氟他胺通过对生成睾酮细胞器的毒性损害和关键酶的抑制，降低了睾酮的分泌量，从而阻碍了性分化和性发育［4］。而有关抗雄性激素物质LIN致生殖发育毒性机理的尚未清楚。本文从亲代SD大鼠妊娠期灌服LIN，对F1代雄性SD大鼠生殖毒性的影响及睾丸差异基因表达、鉴定及分析等方面展开研究，以期为进一步深入了解LIN致生殖发育毒性的机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组及处理 选取清洁级Sprague Dawley(SD)大鼠性成熟个体，雄鼠12只，雌鼠24只，体重200±5 g，由第三军医大学实验动物中心提供。将大鼠随机分为两组，利谷隆组与对照组，按雌雄2∶1分笼交配，室温24℃;获取妊娠雌性SD鼠，利谷隆灌服组于妊娠12 d至17 d灌服浓度为24 mg/mL的利谷隆悬浊液，对照组灌服花生油;于SD鼠孕期第20天解剖取胎鼠，获得胎鼠每组40只，提取睾丸组织中RNA进行基因芯片分析。

1.2 两组子代雄性SD大鼠睾丸组织差异基因谱芯片检测

1.2.1 总RNA的提取及鉴定 用Trizol(Invitrogen公司)提取睾丸组织总RNA。紫外分光光度计检测OD值，要求 A260/A280比值介于1.8～2.0之间，根据 A260计算总 RNA含量。溴化乙锭(Ethidium bromide，EB)染色，1%琼脂糖凝胶电泳观察其完整性。

1.2.2 差异基因谱芯片杂交及分析 差异基因谱芯片杂交委托上海博豪生物科技有限公司完成。芯片结果采用GeneChip®Scanner 3000(P/N 00－00212，Affymetrix)进行扫描，用 Command Console Software 3.1(Affymetrix)读取原始数据，质控合格的数据采用Gene Spring Software 11.0(Agilent)进行归一化处理，所用的算法为MAS5.0。运用Affymetrix网上分析中心通过快速查询(Quick Query)获取生殖有关功能基因的相关信息。差异基因表达筛选标准:a、以 P＜0.05且 FC≥2为标准;b、以 Signal Log Ratio≥1或≤ －1为阈值。

2 结果

2.1 总RNA完整性检测 将提取的子代雄性大鼠睾丸组织总RNA经1.5%琼脂糖凝胶电泳以检测总RNA的完整性，检测结果(见图1)，结果显示总RNA的28S和18S两条带比较清晰完整，表1显示RNA经分析表明28S与18S的比值均在1.5左右，经核酸浓度测定仪检测A260/A280比值为1.9～2.0，表明提取的总 RNA 无降解，纯度高，可用于基因表达谱芯片杂交。

图1 子代雄性大鼠睾丸组织总RNA琼脂糖凝胶电泳检测

表1 RNA质量分析

2.2 利谷隆染毒组子代雄性SD大鼠睾丸组织差异基因谱芯片结果

2.2.1 基因差异表达结果 与对照组相比，本试验从基因表达谱数据库中，以P－value小于0.05且FC≥2倍的筛选标准一共筛选到168个差异表达基因，以Signal Log Ratio≥1或≤－1为阈值分别筛选出89个基因表达上调，79个基因表达下调(见图2)。运用Affymetrix网上分析中心通过快速查询(Quick Query)获取与生殖功能相关的差异表达基因的相关信息(见表2)。

图2 基因芯片杂交结果火山图

2.2.3 差异表达基因功能分析 差异表达基因经GO分析，知其分子功能主要参与催化活性(cata lytic activity)(26.2%)、结合活性(binding activity)(24.7%)及转运活性(transport activity)(20%);经生物学过程分析结果得知差异表达基因参与了代谢过程(metabolism)(10%)、生物学调控(biological regulation)(8.6%)、发育过程(developmental process)(7.6%)、生物过程调控(regulation of biological process)(6.5%);通过DAVID软件对差异表达基因的通路分析得知，差异表达基因表达产物参与了PI3K、AMPK、胰岛素信号通路、mTOR信号通路等信号传导过程。

3 讨论

随着基因组技术作为一种高探索性研究的重要工具被广泛应用于毒理学研究时，毒理基因组学亦成为一门新兴学科得到大量的研究报道。毒理基因组学可以快速的检测有毒物质作用于生物体后基因组表达的变化，揭示其可能的致毒机理［5］。然而许多有关生殖毒理差异基因表达的研究仅仅局限于致毒物质对生物体基因变化的研究，反而忽略了动物毒理实验与毒理基因组学联合实验的研究［6］。

基因芯片结果表明有6个差异表达基因参与了生殖(reproduction)发育过程，这些与生殖相关的基因在利谷隆灌服的子代雄性SD大鼠睾丸组织中发生了差异性表达，说明利谷隆致雄性生殖毒性可能是通过诱导这些基因发生差异表达所介导的。表2结果显示妊娠期第12～17天连续每天灌120mg/kg体重剂量的利谷隆，与花生油灌服对照组比较，利谷隆灌服组的雄性子代大鼠睾丸组织中StAR、3β － HSD、P450scc、ABP、5α － 还原酶等与雄性生殖生理密切相关基因均下调表达，而Cox7a2等基因上调表达。

雄激素的合成是由胆固醇经一系列酶催化作用而生成的，胆固醇经线粒体内膜由类固醇激素合成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein，StAR)蛋白完成，胆固醇裂解为孕烯醇酮由细胞色素P450侧链裂解酶(cytochrome P450，family 11，subfamily a，P450scc)催化，孕烯醇酮变成孕酮由3β－羟甾脱氢酶(hydroxy－delta－5－steroid dehydrogenase，3β－HSD)催化，这3个反应构成了类固醇激素合成的限速步骤。StAR、3β－HSD、P450scc三者在雄性生殖中具有重要的作用，一些研究表明利谷隆及其他抗雄性激素均可诱导其表达变化，与Wilson等的报道不同的是，Wilson等报道利谷隆不可诱导StAR基因的表达差异［7］;Barlow等与Lehmann等报道邻苯二甲酸可诱导3β－HSD与P450scc的mRNA丰度显著性降低［8］。这些研究结果与本试验结果大致相符，表明利谷隆诱导的雄性生殖毒性可能是通过抑制睾酮合成相关酶的基因表达，干扰了睾酮的生物合成过程。

另外，Cox7a2抑制LH诱导的睾酮合成，降低stAR蛋白的表达，升高ROS水平，该研究结果表明Cox7a2可通过抑制类固醇合成快速调节蛋白StAR的表达调控睾酮分泌，和增高ROS水平有关［9］。这些都证实了利谷隆具有抗雄性激素样作用。

研究表明，利谷隆染毒可能通过改变睾丸发育相关基因及睾酮合成相关基因的表达异常，是导致SD雄性子代大鼠生殖发育毒性的机制之一。

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