不同NFC/NDF饲粮和硫胺素对奶牛瘤胃代谢的影响

蔡晶晶 王洪荣 付 聪 李志腾 朱婧靓

(扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009)

反刍动物的瘤胃能够合成硫胺素、核黄素、烟酸、叶酸、生物素等B族维生素，B族维生素主要以辅酶形式催化蛋白质、碳水化合物和脂肪代谢中的各种反应，对反刍动物的正常生命活动具有重要意义。其中硫胺素在反刍动物碳水化合物代谢中具有重要作用，过去研究认为幼龄反刍动物(0～4月龄)因瘤胃功能发育尚不完全需要补充硫胺素，而成年反刍动物因其瘤胃微生物能够合成充足的硫胺素以满足自身的营养需要［1］，在饲粮中不需要添加。但近年来为提高生产效益而采用集约化、规模化、高精饲料的饲养模式，导致亚急性瘤胃酸中毒(SARA)等营养性代谢疾病发病率的升高，而防治SARA的传统措施是添加碳酸氢钠等缓冲剂来中和有机酸，以及添加离子类载体抗生素如莫能菌素等以降低瘤胃中乳酸和挥发性脂肪酸(VFA)的产生。但碳酸盐只能在短时间内起到缓解酸中毒的作用，而抗生素由于药物的残留问题，被逐渐禁用［2］。因此寻求一种安全高效的缓解瘤胃酸中毒的物质具有深远的意义。最近研究表明，硫胺素代谢与瘤胃酸中毒的发生关系密切。张红伟［3］研究山羊体外高精饲料饲粮条件下添加硫胺素对瘤胃发酵的影响，发现硫胺素可以提高瘤胃液pH，显著降低瘤胃液乳酸浓度和乙酸比例。董淑红［4］研究硫胺素对SARA状态下山羊瘤胃内环境的影响，结果表明，饲粮中添加硫胺素以后，瘤胃液pH显著升高，乳酸和总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度有下降趋势，瘤胃液和血液中的组胺和内毒素浓度有下降趋势。在临床上也有皮下注射硫胺素制剂作为治疗瘤胃酸中毒辅助方法的报道。目前，硫胺素对山羊瘤胃酸中毒关系的研究已经取得一定进展，然而关于硫胺素对奶牛瘤胃发酵的影响及对高精饲料饲养条件导致的瘤胃酸中毒关系的研究报道甚少。本试验旨在研究不同非纤维性碳水化合物和中性洗涤纤维比(NFC/NDF)饲粮对荷斯坦奶牛瘤胃内环境的影响，在荷斯坦奶牛发生SARA的状态下，研究添加硫胺素对SARA的缓解作用，探讨硫胺素应用效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用硫胺素为盐酸盐硫胺素(thiamine hydrochloride)，由美国Sigma-Aldrich公司生产，试剂级，有效成分含量≥99%。

1.2 试验动物

从扬州大学试验牧场选取3头身体健康、体重接近且安装有永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛作为试验动物。

1.3 基础饲粮及饲养管理

设计3种试验饲粮，A组、B组和C组分别饲喂 NFC/NDF为1.41(精粗比 5∶5)、NFC/NDF 为2.01(精粗比 7∶3)、NFC/NDF 为 2.01(精粗比7∶3)+180 mg/kg硫胺素的试验饲粮。硫胺素以盐酸硫胺素的形式添加(添加剂量的筛选主要依据于本课题组前期体外培养中硫胺素添加量的试验结果［5］)。每日08:00和20:00分2次等量饲喂，自由饮水，常规光照和管理。精饲料组成见表1，硫胺素添加量、试验饲粮组成及营养水平见表2。

1.4 试验设计

采用3×3完全拉丁方试验设计(表3)，试验持续69 d，分3期进行，每期23 d，每期中预试期20 d，正试期 3 d。

1.5 瘤胃液样品的采集

采样时间为饲喂后的 0、3、6、9 和 12 h，将瘤胃食糜经4层纱布过滤，采集新鲜瘤胃液立即测定pH，然后将瘤胃液分装于10 mL离心管中，将样品置于-20℃冰箱中冷冻保存，以备测定其他内环境指标。

表1 精饲料组成(风干基础)Table 1 Composition of the concentrate(air-dry basis) %

1.6 测定指标、方法及主要的仪器

1.6.1 pH

瘤胃液pH使用雷磁pHS-3C型pH计测定。

1.6.2 NH3-N浓度

瘤胃液NH3-N浓度使用水杨酸钠-次氯酸钠比色法［6］测定。

1.6.3 乳酸浓度

瘤胃液乳酸浓度使用对羟基联苯法［7］测定。

1.6.4 VFA浓度

瘤胃液经10 000×g离心10 min后，取上清1 mL加0.2 mL 20%含60 mmol/L巴豆酸的偏磷酸，混匀后10 000×g离心10 min，取上清液用0.45μm的水系滤膜过滤，取过滤后的上清液0.4μL用日本岛津GC-9A气相色谱仪［8］测定。

1.7 数据处理

本试验的数据用 Excel初步整理后，采用SPSS 16.0软件中的one-way ANOVE进行方差分析，Duncan氏法进行多重比较。

2 结果

2.1 不同NFC/NDF饲粮和硫胺素对奶牛瘤胃液p H的影响

由表4可知，瘘管牛在采食结束后瘤胃液pH逐渐降到最低点，随后由于瘤胃本身的缓冲能力，pH逐渐上升至第2次采食后又出现类似的变化趋势。不同饲粮条件下，pH随采样时间点的变化都呈现先升高后降低的趋势。A组的pH在6 h显著低于其他采样时间点(P＜0.05)，在采食后的6 h内B组在不同时间点的pH都差异显著(P＜0.05)，C组在0和12 h的pH 高于3、6和9 h，差异显著(P＜0.05)。

随着饲粮NFC/NDF的增加，在各个时间点B组瘤胃液pH与A组相比显著降低(P＜0.05)。饲粮中添加硫胺素以后，C组各时间点瘤胃液pH与B组相比有升高趋势，但差异不显著(P＞0.05)。

表2 硫胺素添加量、试验饲粮组成及营养水平(干物质基础)Table 2 Thiamin supplemental level，and composition and nutrient levels of trial diets(DM basis) %

表3 拉丁方设计Table 3 The Latin square design

2.2 不同NFC/NDF饲粮和硫胺素对奶牛瘤胃液NH3-N浓度的影响

由表5可知，各组NH3-N浓度变化趋势相似，总体呈随着发酵时间的延长先升高后下降的趋势，均在采食后3 h达最高。A组在采食后的6、9和12 h的NH3-N浓度差异不显著(P＞0.05)，显著低于采食后0和3 h的NH3-N浓度(P＜0.05)。B组的NH3-N浓度在采食后6和9 h无显著变化(P＞0.05)，其他各时间点间均存在显著差异(P＜0.05)。C组的NH3-N浓度在0和3 h不存在显著差异(P＞0.05)，在6 h显著降低(P＜0.05)，在9和12 h持续降低，与前3个时间点存在显著差异(P＜0.05)。

随着饲粮NFC/NDF的增加，B组和A组相比，各时间点NH3-N浓度均显著或极显著上升(P＜0.05或P＜0.01)。饲粮添加硫胺素后，C组和B组相比，各时间点NH3-N浓度均显著降低(P＜0.05)。

表4 不同NFC/NDF饲粮和硫胺素对奶牛瘤胃液p H的影响Table 4 Effects of different dietary NFC/NDF and thiamine on rumen fluid pH in dairy cows

表5 不同NFC/NDF饲粮和硫胺素对奶牛瘤胃液NH3-N浓度的影响Table 5 Effects of different dietary NFC/NDF and thiamine on rumen fluid NH3-N concentration in dairy cows mg/dL

2.3 不同NFC/NDF饲粮和硫胺素对奶牛瘤胃液乳酸浓度的影响

由表6可知，各组乳酸浓度变化趋势相似，采食后出现先升高后降低的趋势。A组乳酸浓度在0、3、6、9 h 4 个时间点均差异显著(P ＜0.05);B组在饲喂后的3 h乳酸浓度达最高，显著高于其他各时间点(P＜0.05)，不同时间点之间变化的幅度和范围较大;添加硫胺素的C组在采食后6 h乳酸浓度较3 h显著降低(P＜0.05)，9和12 h进一步显著降低(P＜0.05)，而这2个时间点之间差异不显著(P＞0.05)。

随着饲粮NFC/NDF的增加，0和9 h时，B组乳酸浓度与A组相比极显著上升(P＜0.01)，在3、6和12 h，则呈现显著上升的趋势(P＜0.05)。饲粮添加硫胺素后，C组和B组相比，9 h时乳酸浓度极显著降低(P＜0.01)，其他各时间点乳酸浓度均显著降低(P＜0.05)。

2.4 不同NFC/NDF饲粮和硫胺素对奶牛瘤胃液VFA浓度和比例的影响

由表7可知，随着瘤胃内发酵时间的延长，A组的乙酸、丙酸和丁酸比例及乙酸/丙酸受不同采样时间点的影响较小，TVFA浓度先升高后降低，3、6、9 h变化显著(P ＜0.05)，而 12 h恢复到 0 h时的水平;B组乙酸比例和乙酸/丙酸呈现先降低在升高再降低的趋势，丙酸、丁酸比例和TVFA浓度呈现先升高再降低的趋势;C组在采食后3 h，乙酸比例和乙酸/丙酸较0 h显著降低(P＜0.05)，而丙酸比例和TVFA浓度显著升高(P＜0.05)。

饲粮NFC/NDF的增加，B组与A组相比，乙酸比例极显著降低(P＜0.01)，丙酸和丁酸比例显著或极显著上升(P＜0.05或P＜0.01)，乙酸/丙酸显著或极显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，TVFA浓度除0 h无显著差异(P＞0.05)外，其他各时间点均显著降低(P＜0.05)。饲粮中添加硫胺素后，C组与B组相比，乙酸比例显著或极显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，丙酸比例显著或极显著升高(P＜0.05或P＜0.01)，丁酸比例采食6 h后呈现降低的趋势，差异不显著(P＞0.05)，乙酸/丙酸显著或极显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，TVFA浓度除了6和9 h显著降低外，其他时间点无显著变化(P＞0.05)。

表6 不同NFC/NDF饲粮和硫胺素对奶牛瘤胃液乳酸浓度的影响Table 6 Effects of different dietary NFC/NDF and thiamine on rumen fluid lactic acid concentration in dairy cows mmol/L

表7 不同NFC/NDF饲粮和硫胺素对奶牛瘤胃液VFA浓度和比例的影响Table 7 Effects of different dietary NFC/NDF and thiamine on concentration and proportion of rumen fluid VFA in dairy cows

3 讨论

3.1 不同NFC/NDF饲粮和硫胺素对奶牛瘤胃液p H的影响

pH是瘤胃内重要的生理指标，瘤胃酸度对维持瘤胃内环境相对恒定具有主导作用，维持pH在正常范围内是保证瘤胃正常发酵的前提条件之一。在反刍动物饲养过程中，饲粮水平、饲喂方法、咀嚼、唾液分泌及瘤胃内乳酸及VFA等其他有机酸和NH3-N的生成、吸收和排除等因素均会影响瘤胃液的pH［9-10］，但引起瘤胃液pH波动的根本原因是饲粮结构与营养水平［11］。反刍动物采食后，饲粮中的NFC快速发酵产生的有机酸降低瘤胃液pH，但随后有机酸被微生物利用进入真胃或被瘤胃壁吸收，有机酸浓度又逐渐下降，使得pH在采食后呈现先降低再上升的变化趋势。

目前，瘤胃液的pH是判定反刍动物酸中毒及区分急性与亚急性瘤胃酸中毒常用的指标［12］。有学者认为瘤胃液pH低于5.8时，纤维素分解菌活性下降，基于这种考虑，Yang等［13］将5.8作为判定SARA发生的阈值。Penner等［14］仅根据瘤胃的pH将瘤胃酸中毒划分为轻度酸中毒(5.5≤pH＜5.8)、中度酸中毒(5.2≤pH＜5.5)及急性酸中毒(pH＜5.2)3种情况。本试验中饲喂饲粮NFC/NDF为2.01的瘘管牛，瘤胃液pH介于5.41～5.96波动，认为已经处于SARA的状态。在饲粮中添加180 mg/kg的硫胺素，结果表明，添加硫胺素可以提高瘤胃液pH，但与正常状态下奶牛瘤胃液pH比较，仍存在显著差异，只是在一定程度上缓解瘤胃的酸性环境，降低SARA对机体的损害，但是却不能完全避免SARA对动物生产性能的影响。

3.2 不同NFC/NDF饲粮和硫胺素对奶牛瘤胃液NH3-N浓度的影响

瘤胃微生物的生长需要多种营养物质的供应，其中碳源和氮源是保证微生物生长最重要的营养素，在有能量和碳源的情况下，瘤胃内NH3-N是微生物合成菌体蛋白质的主要氮源。瘤胃内NH3-N浓度是瘤胃内环境的重要参数，NH3-N浓度主要受到饲料蛋白质可溶性、唾液内尿素量、氮在瘤胃内的吸收利用、微生物的利用和瘤胃食糜进入后消化道的影响，一定程度上反映出微生物对饲粮蛋白质的降解程度及微生物种群利用氨态氮的能力。如果NH3-N浓度过高，则说明瘤胃微生物降解氮源释放氨气的速率超过微生物合成菌体蛋白的速率，这样就增加了氮循环中氮素的损失，但是NH3-N浓度过低又会限制瘤胃微生物合成菌体蛋白［15］。

很多研究表明，早晨饲喂反刍动物后，瘤胃内微生物生长需要的营养成分浓度升高，各种微生物快速增殖，加速了饲粮中蛋白质的降解速度，使得NH3-N浓度上升，随着氨被微生物吸收利用，NH3-N浓度逐渐下降并趋于平缓，本试验结果与上述研究结果是一致的。B组饲粮NFC/NDF高于A组，为瘤胃微生物生长提供了充足的能量，使得微生物活性增强及蛋白质降解能力提高，因此B组NH3-N浓度高于A组。饲粮添加硫胺素的C组的NH3-N浓度低于未添加的B组，说明添加硫胺素能够促进微生物对氨的利用，提高菌体蛋白的产量。

3.3 不同NFC/NDF饲粮和硫胺素对奶牛瘤胃液乳酸浓度的影响

段得贤等［16］研究认为，在正常瘤胃发酵状态下，乳酸不是瘤胃发酵的重要中间产物，也不能被瘤胃壁吸收。但许多研究已经证实，瘤胃发酵异常时，瘤胃内乳酸浓度增加是急性酸中毒产生的直接原因，但在SARA发病中乳酸的作用却无定论。Keunen等［17］研究表明，反刍动物发生SARA时瘤胃内的乳酸浓度不会超过10 mmol/L。Beauchemin等［18］认为发生瘤胃 SARA时瘤胃内根本不存在乳酸。Plaizier等［19］研究发现，奶牛发生亚急性瘤胃酸中毒时乳酸浓度在0.45～0.74 mmol/L的范围内变化。胡红莲［20］研究表明，山羊在发生亚急性瘤胃酸中毒时，乳酸含量较低，在全程内均低于1 mmol/L。患有亚急性瘤胃酸中毒的动物，其患病时间、病情的严重程度等都有可能造成乳酸浓度数值上的差异，测定对象正常指标之间具有的差异性、测定方法等对数值的差异也会有一定影响，也会导致系统误差的存在。

在本试验中随着饲粮NFC/NDF的增加，B组的乳酸浓度高于A组，饲粮添加硫胺素后，C组的乳酸浓度与A组相比仍存在显著差异，说明添加硫胺素能降低乳酸浓度，但不能完全降至正常饲粮所能产生的乳酸水平。其中硫胺素可能是促进了乳酸利用菌对乳酸的利用，进而导致乳酸浓度降低，但具体作用机制还有待于进一步的研究。

3.4 不同NFC/NDF饲粮和硫胺素对奶牛瘤胃液VFA浓度和比例的影响

VFA中的乙酸、丙酸、丁酸是瘤胃中碳水化合物发酵的主要终产物，可提供反刍动物总能量需要的70% ～80%，同时也是显示瘤胃发酵、消化等代谢活动状况的重要指标之一。乙酸在体内主要通过乙酰辅酶A在还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的作用下合成体脂和乳脂，在体内储存能量并提高乳脂率，少部分的乙酸进入三羧酸循环循环生成水和二氧化碳，释放ATP供能。丙酸作为生糖前体，在肝脏合成糖原，也可合成少量乳酸。丁酸以β-羟丁酸的形式在乳腺组织和肝脏中参与体内物质代谢，也可作为肌肉组织来源。影响瘤胃中VFA浓度和比例的因素很多，但其中最根本的原因是饲粮的结构问题。当精粗比发生改变时，瘤胃液中各种VFA的比例也会发生变化，这是由于淀粉分解菌和纤维素分解菌随饲粮类型的不同，其优势菌所占比例发生改变。一般来说，粗饲料在瘤胃中产生高比例乙酸，而精饲料则产生高比例丙酸。

正常情况下，随着采食时间的推移，采食后瘤胃内微生物发酵产生大量的VFA，随后瘤胃微生物利用和瘤胃壁吸收同步进行，VFA的浓度又会下降。本研究得出，随着饲粮NFC/NDF的增加，丙酸和丁酸的比例呈现递增趋势，而乙酸比例、乙酸/丙酸呈现降低趋势，这与王吉峰等［21］的研究结果一致。但TVFA的浓度却呈下降趋势，这与诸多学者如胡红莲［20］和 Ghorbani等［22］的研究结果报道不一致。可能是因为前期饲喂粗饲料比例较高，纤维素和半纤维素产生的乙酸含量高，而在酸中毒比较严重的阶段，奶牛的采食量显著下降，导致发酵产生的 VFA含量下降，这与董淑红［4］以70%精饲料水平饲喂奶山羊时TVFA浓度出现下降结果一致。饲粮中添加硫胺素，乙酸比例、乙酸/丙酸呈现降低的趋势，丙酸、丁酸比例呈现上升趋势，这与董淑红［4］研究结果一致。奶牛患有SARA是由于瘤胃内产生的过量VFA超过瘤胃绒毛的吸收能力造成的，VFA在瘤胃内蓄积则pH降低［23］。添加硫胺素在一定程度上降低了TVFA在瘤胃内的蓄积。添加硫胺素能够改变瘤胃的发酵方向，使得VFA的组分比例发生变化，促进丙酸合成，减少乙酸的生成，而丙酸是体脂合成的重要碳素来源，也是合成葡萄糖的前体(丙酸在反刍动物体内可以提供50%的葡萄糖来源)。

4 结论

①诱导奶牛发生SARA过程中，pH下降速率和幅度随之增大，NH3-N浓度显著上升，乳酸浓度显著升高，乙酸比例、乙酸/丙酸呈现下降趋势，丙酸和丁酸比例呈现升高的趋势。

②饲粮中添加180 mg/kg硫胺素能够缓解SARA，但不能完全消除酸中毒对机体的损害。

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