补肾调肝方抗卵巢衰老的作用机制的研究

陈玉梅 余志惠 黄桂花 沈维增 钟琳 姜焕好

围绝经期综合征是基于卵巢衰老而引发的一系列生理、心理病理性改变，临床以情绪调节障碍及生理机能渐行性衰退为主要表现［1］。中医理论认为“肾藏精，主生殖”，肾阳充盛为女性生殖内分泌系统的物质基础。现代研究表明，卵巢衰老是一个多重环节参与的渐进过程，受神经内分泌系统和生殖内分泌系统的双重调节。卵巢萎缩，雌二醇(estradiol，E2)、卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)、孕酮(pregnendione，P)等雌激素分泌减少是卵巢衰老的早期信号［2，3］;同时，卵巢颗粒细胞凋亡信号广泛性激活，导致卵泡闭锁。本研究以“卵巢颗粒细胞及其细胞因子的变化规律”为主线，观察补肾调肝类方药对卵巢衰老的调节作用，以期为其抗卵巢衰老机制的完善提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 动物和分组 本实验纳入3、6、12、18、24月龄健康Wistar大鼠共计120只，以其月龄为分组标准，分为5组，每组24只;在此标准下，各组大鼠随机分为对照组和干预组各12只，共计10组。

1.2 仪器和器材 切片机(德国Leica公司，LeicaRM2135);电热恒温水浴锅(北京长源实验设备厂，SY11 Wi);光学显微镜(日本 Olympus公司，BX43);低温超速离心机(Beckman，AJ-30I);Mastercycler pro梯度PCR仪(eppendorf，Mastercycler pro);微量电动组织匀装器(北京优尼康生物科技有限公司);核酸蛋白测定仪(Eppendorf公司，Biophotometerplus);凝胶成像分析仪(上海复日科技有限公司，FR-980)等。

1.3 主要试剂 TUNEL试剂盒(天津颧洋生物技术有限公司);总RNA提取试剂盒提取试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，NEP019-1);Oligod(T)1 8 primers(TaKaRa公司，D511);M-MLV RT(Promega公司，M1701);Ribonuclease Inhibitor(TaKaRa公司，D2313A);10 mmol dNTP Mixture(TaKaRa公司，D4030RA);2.5 mmol dNTP Mixture(TaKaRa公司，D4030A);rTaq(含 6Xloading buffer、10XPCRbuffer)(TaKaRa公司，DRIOOA);DL2000 marker(TaKaRa公司，D501A);DEPC(Sigma公司);琼脂糖(BIOWEST，91622);DNAgreenMarker(北京天恩泽，70303);其他常用试剂如氯仿、无水乙醇、氯化钠等均为国产分析纯。

1.4 研究方法

1.4.1 给药及取材方法 干预组以补肾调肝方灌胃干预20 ml/(kg·d)，对照组灌以同等剂量的无菌饮用水;干预15 d，处死取卵巢;各组均选取6例样品浸入4%多聚甲醛液固定，行TUNEL染色;剩余 6例余-70℃超低温冰箱储存，行RT-RCR。

1.4.2 TUNEL染色和凋亡指数(AI)计算方法 TUNEL染色严格按照试剂盒说明书流程进行，封片后以电镜观察卵巢颗粒细胞形态。高倍视野下棕黄色颗粒即为卵巢颗粒细胞，采用Metamorph图像分析系统分析图像;随机选取5～7个视野，以凋亡颗粒细胞占颗粒细胞总数的百分比为AI。

1.4.3 RT-PCR方法 以总RNA提取试剂盒提取卵巢组织mRNA，在Mastercycler pro梯度PCR仪中自动完成常规反转录过程;所得产物以核酸蛋白分析仪测定浓度，作为模板DNA进行扩增。各基因引物序列见表1。

扩增后所得产物为目的mRNA，进行2%琼脂糖凝胶(内含 DNA Green 4 μl/100 ml)电泳，稳压100 V，电泳30-40 min，凝胶成像分析仪观察，计算相对光度值。

表1 引物序列

2 结果

2.1 AI 对照组3、6、12月龄大鼠的AI均处于较低，18、24月龄大鼠AI均显著升高(P＜0.05);与对照组相比，研究组大鼠各月龄AI均显著降低(P＜0.05)。见表2。

2.2 Bax 对照组3、6、12月龄大鼠的Bax mRNA表达处于较低水平，18、24月龄显著升高(P＜0.05);与对照组相比，干预组各月龄大鼠Bax mRNA表达均显著降低(P＜0.05)。见表3。

2.3 Bcl-2 对照组3、6、12月龄大鼠Bcl-2 mRNA表达处于较高水平，18、24月龄显著降低(P＜0.05);与对照组相比，干预组各月龄大鼠Bcl-2 mRNA表达均显著升高(P＜0.05)。见表4。

表2 各组大鼠AI比较(x ± s，%)

表3 各组大鼠Bax mRNA表达比较(±s)

表3 各组大鼠Bax mRNA表达比较(±s)

组别 3个月 6个月 12个月 18个月 24个月对照组 0.321±0.022 0.337±0.018 0.341±0.016 0.884±0.092 0.741±0.063干预组 0.201±0.017* 0.221±0.019* 0.224±0.015* 0.451±0.055▲ 0.446±0.027＊▲

表4 各组大鼠Bcl-2 mRNA表达比较(±s)

表4 各组大鼠Bcl-2 mRNA表达比较(±s)

组别 3个月 6个月 12个月 18个月 24个月对照组 0.612±0.021 0.622±0.032 0.635±0.031 0.224±0.021 0.239±0.015干预组 0.826±0.033* 0.794±0.035* 0.815±0.034* 0.514±0.049▲ 0.507±0.041＊▲

3 讨论

围绝经期综合征以情志障碍和内分泌紊乱为临床两大病理表现，其主要始动因素为卵巢衰退、雌激素水平低下所致卵泡闭锁。颗粒细胞与卵母细胞、及内膜细胞共同构成卵泡的体细胞。研究表明，颗粒细胞主司卵母细胞的营养供应及信号传导，在卵母细胞的生长、分裂和增殖过程中具有的调控重要作用;同时，也是促进卵泡生长发育的主要物质，其凋亡指数AI可间接衡量卵泡的发育状态。Bax与Bcl-2是近年研究较为广泛的两类凋亡因子［4］，广泛存在于胚胎、淋巴、及部分肿瘤组织中。其中Bax可促进凋亡信号的过表达，因而又称促凋亡因子;而Bcl-2基于己身对细胞凋亡过程的显著抑制效应，又称为凋亡抑制因子。

本课题组补肾调肝方是以中医基础理论为基础，结合临床实践而研制的经验方。方中合用菟丝子、川断、蛤蚧以滋阴、温肾、助阳，可稳内分泌;合用白芍、远志以柔肝、宁心可平情志。本研究从现代生物分子学水平上表明，Bcl-2 mRNA低表达及Bax mRNA高表达启动颗粒细胞的调亡过程可能为卵巢衰老的重要机制之一;而补肾调肝方药可显著上调Bcl-2 mRNA表达，同时下调Bax mRNA表达，延缓颗粒细胞的调亡过程，推测可能为其抗卵巢衰老的作用机制之一。

［1］ Zhou B，Sun X，Zhang M，et al.The symptomatology of climacteric syndrome:whether associated with the physical factors or psychological disorder in perimenopausal/postmenopausal patients with anxiety-depression disorder．Arch Gynecol Obstet，2012，285(5):1345-1352．

［2］ Studd JW.A guide to the treatment of depression in women by estrogens．Climacteric，2011，14(6):637-642．

［3］ Graziottin A.Safety，efficacy and patient acceptability of the combined estrogen and progestin transdermal contraceptive patch:a review．Patient Prefer Adherence，2008，2(2):357-367．

［4］ 梁欣韫，牛建昭，杨美娟.育泡饮对自身免疫性POF小鼠卵巢颗粒细胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响．中华中医药学刊，2013，v.3101:21-23．