蔬菜作物的RNA原位杂交技术

柳美玲，丁莲，张小兰

（中国农业大学 农学与生物技术学院，北京 海淀100193）

基因的时空表达模式是探索基因功能的重要手段之一。虽然Northern杂交，半定量PCR（semi－quantitative PCR）、荧光定量 PCR（quantitative real－time PCR）以及免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）等方法都能对基因的表达水平进行检测，但要想在显微或亚显微水平［1］上对基因的表达部位和表达时期上进行分析，这些方法都具有一定的局限性［2～4］。根据核酸分子杂交的基本原理和免疫组织化学的方法发展而来的RNA原位杂交技术（ISH ，in situ hybridization）［5，6］为我们提供了行之有效的途径。

RNA原位杂交技术是分子生物学、组织化学以及细胞学相结合而产生的一门新兴技术。它主要是利用碱基互补的原理，将体外合成的带有标记的单链反义RNA与组织或细胞内RNA靶序列杂交，将反义探针定位在特定基因的表达区域内，从而可以了解组织或细胞内RNA的分布和数量。

目前，RNA原位杂交技术在拟南芥和玉米上使用广泛［7～9］，在烟草、水稻等植物中也 有涉及［10，11］，但是在园艺作物上的应用较少。本文结合拟南芥、玉米上的RNA原位杂交技术和自己的试验经验，以黄瓜为例，对园艺作物RNA原位杂交技术方法进行优化，并对其具体流程和注意事项进行阐述。

1 RNA原位杂交技术的操作流程

1.1 探针的制作

黄瓜原位杂交中一般使用地高辛标记的RNA探针，探针的长度在200～500bp比较合适，设计探针的时候应该尽量选择mRNA的特异区域，如3′或5′UTR区。设计引物时在引物上下游分别加上SP6和T7聚合酶结合序列及保护碱基，通过PCR扩增后进行凝胶回收获得至少2μg DNA产物。取2μg DNA加入200μL PCR管中，然后依次加入10xbuffer（2μL），10xlabeling mix （2μL），RNase inhibitor（1μL），RNApol（2μL，T7或SP6）和适量的H2O使得总体积为20μL，吸打混匀以后放入PCR仪中37℃温浴2h进行反转录。

取1μL反转录合成的RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测合成RNA的质量（电泳槽用0.2mol·L－1NaOH 处理至少30min）。

在含有19μL RNA的PCR管中加入 H2O（75μL），100g·L－1tRNA （1μL），RNAse free DNAse（5U或1μL），放入PCR仪中37℃温浴10 min。

加入等体积（95μL）4mol·L－1NH4Ac，2倍体积（190μL）酒精，于－20℃冰箱放置30min（亦可过夜）后，4℃离心15min，倒掉上清液，加入600μL 70% 酒精清洗两次，4℃离心后尽量除掉残余酒精，放在通风橱中风干。

在装有晾干沉淀的离心管中加入30μL H2O，混匀后测RNA的浓度，然后再加入70μL H2O和100μL 2xcarbonate缓冲液后置于60℃进行水解。水解时间T＝（起始片段长度－最终片段长度）／（k＊起始片段长度＊最终片段长度）；k＝0.11kb·min－1；最适宜终片段长度为150bp。

加入10μL 10% 冰醋酸 ，0.1倍体积的（21 μL）3mol·L－1NaOAc（pH 5.2），2倍体积的（420μL）酒精后于－20℃放置至少3h，也可过夜。然后4℃离心15min，倒掉上清液，加入600μL 70% 酒精清洗两次，4℃离心后尽量除掉残余酒精，放在通风橱中风干。

在上一步得到的带有沉淀的离心管中加入20μL H2O，混匀后测浓度，然后再加入20μL甲酰胺于－20℃冰箱保存。

1.2 斑点杂交——检测探针的质量

取出2μL探针在80℃金属浴加热2min进行变性反应，然后取其中的1μL稀释20倍，将未稀释和稀释后的探针依次点到尼龙膜上形成一个个斑点。等斑点自然风干后进行交联1min，然后将尼龙膜轻轻放入50mL的离心管中。使尼龙膜依次经过以下溶液（溶液的量大约为30mL，以离心管平躺放置没过尼龙膜为标准），并且以下步骤均在摇床上进行。

TBS 溶 液 （5min）——封 闭 缓 冲 液 （30 min）——1%BSA 0.3% 曲 拉 通 的 TBS 溶 液（TBST）（15min）——1／3000anti－DIG－AP的TBST溶液（90min，此步不在摇床上进行）——TBST溶液（3次，15min·次－1）——缓冲液C（5 min）——NBT／BCIP 显色液（10～30min）

根据染色的深浅评价探针的浓度并初步确定杂交时探针的稀释倍数。如图1。

图1 斑点杂交效果图Fig.1 Result of Dot blot

1.3 样品的准备

第一天（冰上）：取样，将样品放在3.7%FAA（用DEPC水配制）中，抽真空直到样品全部沉入瓶底，然后更换新鲜的FAA，4℃摇床上震荡过夜。

第二天（4℃摇床上）：将样品经过酒精梯度进行脱水，每次180min。过酒精梯度时可以在溶液里面加入几滴1%的甲基曙红染色以方便后面的包埋。酒精梯度依次是50%酒精＋10%的8.5%NaCl，70%酒精＋10%的8.5%NaCl，85%酒精＋10%的8.5%NaCl，95%酒精，100%酒精。最后，再更换新鲜的100%酒精（不用加甲基曙红），于4℃摇床上过夜。

第三天（室温摇床上）：换新鲜的100%酒精于室温放置2.5h，然后更换酒精∶脱蜡剂＝1∶1溶液放置1.5h，连续换4次脱蜡剂，每次1.5h，在换最后一次脱蜡剂的时候加入约1／4体积的固体石蜡片于常温过夜。

第四天：将样品转移到42℃烘箱中，等石蜡片全部融化以后更换新鲜的液体石蜡于60℃烘箱过夜（液体石蜡最好提前一天放在60℃烘箱融好备用）。

连续换3天纯液体石蜡，每天早晚各一次，在第四天早晨换完纯蜡至少等待4h以后开始包埋。

从包埋盒中取出已经包埋好的蜡块，用加热的刀片或者解剖刀将蜡块切成若干小蜡块，分开的每个小蜡块中包含一个完整的组织，然后用刀片切除多余的石蜡，将小蜡块修整成正方体或者长方体后将其粘在小木块上。

然后，使用切片机进行切片，切片的厚度一般在8～12μm，切下的片子往往带有皱褶，因此还需要展片，用毛笔挑取石蜡片，放在摊片机上用37℃的DEPC水展片，等到石蜡片充分展平以后，用载玻片在水中捞取石蜡片，然后用吸水纸吸干多余的水分，将载玻片置于37℃的烤片机上烤片12～36h。由于组织切片要在各种溶液中反应时间较长，因此粘片一定要牢固，我们使用的载玻片是Fisher Scientific公司的，由于这些载玻片经过硅化处理，表面的疏水性较强，因此从水中捞取石蜡片以后一定要将多余的水分充分吸干，以免影响粘片的效果。

1.4 预杂交和杂交

1.4.1 预杂交

将选好的石蜡切片依次经过以下溶液（将500mL溶液倒入一个约600mL的玻璃缸中，如图2A，将选好的片子放入金属玻片架中，如图2C，然后将玻片架放入玻璃缸中进行以下试验，如图2B）。

图2 原位杂交所用耗材Fig.2 Consumables of the in situ hybridization

脱蜡剂（2次，10min·次－1）——100%酒精（2次，1min·次－1）——95%酒精（30s）——85%酒精，0.85%NaCl（30s）——70% 酒精，0.85%NaCl（30s）——50%酒精，0.85%NaCl（30s）——30%酒精，0.85%NaCl（30s）——0.85%NaCl（2min）——PBS（2min）－ 蛋白 酶 K 溶液 （30 min，37℃）——0.2% 甘 氨 酸 的 PBS 溶 液 （2 min）——PBS（2次，2min·次－1）－4%甲醛的PBS溶液（10min，磁力搅拌器搅拌）——PBS（2次，2min·次－1）——乙酸酐溶液（10min，pH＝8，磁力搅拌器搅拌）——PBS（2次，2min·次－1）－0.85%NaCl（2min）——30%酒精，0.85%NaCl（30s）——50%酒精，0.85%NaCl（30s）——70%酒精，0.85%NaCl（30s）——85% 酒精，0.85%NaCl（30s）——95%酒精（30s）——100%酒精（1 min）——100%酒精（1min，少量）。

样品可于装有少量100%酒精玻璃缸中存放数小时，待酒精挥发完全即可进行下面的实验。

1.4.2 杂交

依据斑点杂交结果将探针稀释于50%甲酰胺溶液中。探针和杂交液的总用量以能覆盖所有的组织为标准，一般每张载玻片用量为150μL，探针和杂交液的体积比为1∶4，将探针杂交液加到载玻片上以后，用枪头轻轻将其摊开，盖上盖玻片，尽量避免气泡，置于有由2×SSC／50%甲酰胺浸湿的吸水纸的托盘中，密封放于50℃烘箱中过夜。杂交过程涂完探针杂交液后，盖盖玻片的时候一定要注意尽量避免产生气泡，气泡的存在会直接影响杂交的质量。另外，杂交反应过程一定要保持一定的湿度，由于杂交反应需要过夜，时间较长，因此2×SSC／50%甲酰胺溶液的用量适量增加以防第二天变干。

1.5 洗片以及显色

在55℃0.2×SSC溶液中将盖玻片洗掉，然后依次经过以下溶液：55℃0.2×SSC溶液（2次，1 h·次－1）——37℃ NTE 溶 液 （2 次，5min·次－1）——37℃20μg·mL RNAse A 的 NTE溶液（30min）——37℃ NTE 溶液（2次，5min·次－1）——55℃0.2×SSC溶液（1h）－TBS溶液（5min）——罗氏封闭液（45min，摇床）——TBST溶液（45min）。将抗体用TBST溶液稀释1250倍涂于样品上，避光保湿室温放置2h。

之后，用TBST溶液清洗4次，每次15min，然后再用缓冲液C（鲜配）清洗5min，最后加NBT／BCIP进行显色，显色的过程一定要避光。1－3天后用TE缓冲液洗片，置于显微镜下观察。最后用封片剂封片，长期保持。

1.6 部分溶液配方

2xcarbonate缓冲液：80mmol·L－1NaHCO3，120mmol·L－1Na2CO3

FAA（3.7%）：50%酒精，5%冰醋酸，3.7%甲醛

蛋白酶 K 溶液：100mmol·L－1Tris pH8溶液，50mmol·L－1EDTA。先在37℃预热，使用之前加入1μg·mL－1蛋白酶K即可。

乙酸酐溶液：3mL乙酸酐加入600mL 0.1 mol·L－1triethanolamine－HCl，然后再用 NaOH调溶液的酸碱度到pH＝8.

TBST溶液：1%BSA，0.3% 曲拉通 X－100，1XTBS，60℃搅拌助溶。

杂交液：0.3mol·L－1NaCl，10mmol·L－1Tris－HCl pH6.8，10mmol·L－1NaHPO4pH6.8，5mmol·L－1EDTA，50%甲酰胺，10%硫酸葡聚糖，1×Dernhardts，1g·L－1tRNA。

缓冲液 C：100mmol·L－1Tris－HCL（pH 9.5），50mmol·L－1MgCl2，100mmol·L－1NaCl

2 注意事项

2.1 样品选择

RNA原位杂交技术对幼嫩组织比较适用，很老的组织如叶片、粗壮的茎等很难取得好的杂交结果。因此，在样品的选择上尽量选用幼嫩组织和部位。

2.2 样品固定

因园艺作物鲜嫩多汁，水分含量多，如黄瓜的果实，样品固定时酒精梯度可加密，通常增加30%和60%两个梯度。并且，每个酒精梯度固定时间也可适当延长到3h。

2.3 切片厚度

大多做RNA原位杂交的切片厚度是8～12 μm，但对特殊样品，如黄瓜上的果刺细胞，因其细胞大，水分多，切片厚度可增加到20μm。

RNA原位杂交使用的是RNA探针，合成RNA探针最关键的是防止RNase污染，因此整个RNA原位杂交流程（除洗片和显色外）用到的耗材都要进行DEPC处理以去除RNase。

由于整个过程步骤多耗时长，操作时动作要轻，避免破坏样品的完整性。

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