越橘花色苷对血管内皮细胞微波辐射损伤的保护作用

朱文赫，张 巍，李 妍，徐俊杰，姜艳霞，罗 军，芦晓晶，吕士杰

（吉林医药学院生物化学与分子生物学教研室，吉林 吉林 132013）

随着微波（频率300MHz～300GHz）技术的发展，微波在通讯家用电器工业和军事等领域的应用越来越广泛，人们受微波辐射的机会越来越多，潜在的危害不容忽视[1－3]。因此，研究辐射损伤防治手段，寻找积极有效的防治药物已成为一个急待解决的问题。从自然资源中寻找并提取有效的预防和治疗辐射的药物成分，从而研究开发抗辐射作用的药物是目前的主要研究方向[4]。越橘又称蓝莓果，属于杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium.spp）多年生落叶或常绿灌木，在全世界广泛分布[5]。越橘果实中的主要成分花色苷是一种天然的抗氧化剂，具有抗氧化、清除自由基等多种功能[6]，不仅抗氧化效果显著，且对人体无任何毒副作用。国内外有关越橘保护毛细血管、抗氧化、延缓脑神经衰老、增强记忆力、消除体内炎症和抗癌作用等方面的研究[7]报道较多。然而关于越橘提取物对微波辐射损伤保护作用的研究尚未见报道。为充分利用越橘植物资源，本研究提取野生种越橘中花色苷，对其抗微波辐射作用进行研究，旨在为越橘的综合利用和开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器 人脐静脉内皮细胞

EVC 304由吉林医药学院生物化学教研室保存，长白山野生笃斯越橘为8月份采收，于－80℃冰箱中保存备用；小牛血清购于杭州四季青公司，RPMI-1640培养液购于美国Gibco公司，MY8C-1型微波功率源（频率为2 450MHz）购于南京汇研微波系统工程有限公司，550酶标仪购于美国Bio-Rad公司；UV-4802型紫外可见分光光度计购于上海UNICO仪器有限公司，RE-52AA旋转蒸发器购于上海亚荣生化仪器厂，SHZ-D型循环水式多用真空泵购于巩义市予华仪器有限责任公司，TGL-16G台式高速离心机购于上海安亭科学仪器厂。

1.2 越橘花色苷的制备 越橘花色苷制备参照文献[8]的方法，取出冷冻保存的长白山笃斯越橘，研磨至匀浆状，按1∶5比例加入95%乙醇和1.5mol·L－1HCl（85∶15）作为溶剂进行微波辅助提取，用真空抽滤去残渣，采用旋转蒸发仪浓缩花色苷提取液。采用pH示差法[9]测定花色苷质量分数，取1.0mL样品提取液，分别用pH 1.0和4.5的缓冲液定容至10mL，室温下放置15min，以蒸馏水作参比，用分光光度计在450～700nm波长间扫描最大吸收峰，并测定在最大吸收峰处和700nm处的吸光度（A）值，计算花色苷的质量分数。花色苷质量分数C（mg·g－1）＝A×V×n×M/（ε× m）A ＝（Amax－A700）pH1.0－（Amax－A700）pH4.5Amax分别为pH 1.0和4.5时花色苷在最大吸收峰处的A值；V为提取液总体积（mL）；n为稀释倍数；M 为矢车菊-3-葡萄糖苷（Cy-3-Glu）的相对分子质量（449）；ε为Cy-3-Glu的消光系数（29 600），m为样品质量（g）。

1.3 EVC 304细胞增殖抑制率的测定 将人脐静脉内皮细胞EVC 304培养于含10%小牛血清的DMEM培养液中，置于37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。每2d更换培养液1次，待细胞长满至培养瓶底，以0.25%胰酶消化传代。取对数生长期细胞进行实验，调整细胞密度为1×105mL－1，接种于96孔孔板，每组设5个复孔。分成对照组、微波辐照组和花色苷组，花色苷组细胞分别加入25、50和100mg·L－1花色苷，24h后，微波辐照组和花色苷组细胞以强度为20mW·cm－2的2 450MHz微波辐射20min，对照组细胞不做任何处理。分别于6、12、18和24h进行MTT实验。弃掉培养液，每孔加入200μL新配制的终浓度为0.5g·L－1MTT溶液，37℃孵育4h，小心吸弃孔内液体，每孔再加入DMSO 150μL，振荡10min，选择490nm在酶标仪检测各孔A值，按公式计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率＝（1－实验组A值/对照组A值）×100%。

1.4 流式细胞术检测细胞周期 将培养的EVC 304细胞以1×105mL－1的密度接种于6孔板，每

组设3个复孔，分成对照组、微波辐射组和花色苷组，花色苷组细胞分别加入浓度为25、50和100mg·L－1花色苷，24h后，微波辐照组和花色苷组细胞以强度为20mW·cm－2的2 450MHz微波辐射20min，对照组不做任何处理。微波辐射作用后24h，收集细胞，PBS洗2次，75%冷乙醇固定，上机前离心弃乙醇，PBS洗2次，重新悬浮于1mL PBS，加入 RNase（100mg·L－1）10μL，5g·L－1碘化乙啶（PI）染色剂10μL，避光染色20min，采用流式细胞术检测细胞周期变化。

1.5 EVC304细胞的caspase-3活性检测 将对数生长期的细胞分成对照组、微波辐射组和花色苷组，处理方法同1.4所述。培养24h收集细胞，以细胞裂解液裂解，10 000r·min－1离心15min，取上清，用Bradford法测定蛋白浓度。向上清中加入caspase-3底物，37℃孵育60min，测定A405值，根据标准曲线计算caspase-3的活性。

1.6 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理。细胞增殖抑制率以（±s）%表示，各细胞周期细胞比例和caspase-3活性均以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 越橘花色苷的鉴定 紫外分光光度仪测定所提取的越橘花色苷的最大吸收波长为520nm，符合花色苷类物质在可见光区520～560nm范围内有最大吸收光谱的特点。在最优提取条件下花色苷的产量达到了0.402mg·g－1（湿重）。越橘花色苷的吸收光谱见图1。

图1 越橘花色苷的吸收光谱图Fig.1 Absorption spectrum of Bilberry anthocyanidin

2.2 各组EVC304细胞增殖抑制率 微波辐射后6～24h，受辐射后的各组细胞增殖活性均受到不同程度损伤，20mW·cm－2微波辐射在24h内使细胞增殖抑制率变化为8.4%～58.6%。而在25、50和100mg·L－1的浓度范围内，越橘花色苷能够有效地提高细胞的增殖活性，并呈现一定的剂量－效应关系。在100mg·L－1的浓度时，EVC304细胞增殖活性显著提高，24h细胞增殖抑制率降至30.5%。见表1。对照组细胞呈扁平状，长梭形、多角形或椭圆形镶嵌状排列，细胞边界清晰，大小均匀，细胞丰满，胞核居中，无重叠生长现象。微波辐射组细胞出现收缩、变圆、体积变小，细胞间隙增宽，大部分细胞有破碎、脱落的现象。不同剂量花色苷组细胞形态比微波辐射组有所改善。见图2。

2.3 各组EVC304细胞周期和细胞凋亡率 经过微波辐射后，EVC304细胞表现为S期细胞比例降低，G2/M期细胞比例增多，凋亡细胞比例增加。

表1 不同时间各组EVC304细胞增殖抑制率Tab.1 Inhibitory rates of proliferation of EVC304cells at different time in various groups [η/（±s）%]

表1 不同时间各组EVC304细胞增殖抑制率Tab.1 Inhibitory rates of proliferation of EVC304cells at different time in various groups [η/（±s）%]

＊ P＜0.05 vs microwave radiation group.

Group Inhibitory rate of p.2 58.6±0.8 25mg·L－1 anthocyanidin 8.2±0.5 14.0±3.1 35.0±2.7＊ 52.0±3.8＊50mg·L－1 anthocyanidin 7.5±2.3＊ 13.0±1.8＊ 27.0±3.5＊ 47.0±4.7＊100mg·L－1 anthocyanidin 6.8±1.8＊ 12.0±2.7＊ 26.0±3.2＊ 30.5±4.0 6 12 18 24 Microwave radiation 8.4±0.9 15.0±2.8 37.0±2 roliferation（t/h）＊

25、50和100mg·L－1花色苷组G1/G0期细胞比例高于对照组和微波辐射组（P＜0.05）。而微波辐射后加入不同浓度的越橘花色苷对损伤的EVC304具有明显的修复作用，25、50和100mg·L－1花色苷组细胞凋亡率明显下降，与微波辐射组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

图2 各组EVC304细胞形态学（×400）Fig.2 Morphology of EVC 304cells in various groups（×400）

表2 各组EVC304细胞周期和凋亡率Tab.2 Cell cycle and apoptotic rates of EVC304cells in various groups [η/（±s）%]

表2 各组EVC304细胞周期和凋亡率Tab.2 Cell cycle and apoptotic rates of EVC304cells in various groups [η/（±s）%]

＊ P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs microwave radiation group.

Group Percentage of EVC304cells G1/G0 S G2/M Apoptosis ratio 61.7±1.1 20.4±2.2 14.5±2.8 2.9±0.2 Microwave radiation 56.8±1.5＊ 15.2±1.7＊ 13.1±2.7 14.9±2.3＊25mg·L－1 anthocyanidin 66.1±2.1＊△ 14.2±1.6＊ 13.6±1.3＊ 6.1±1.3＊△50mg·L－1 anthocyanidin 66.3±1.4＊△ 15.3±1.2＊ 14.1±2.6△ 4.2±1.9＊△100mg·L－1 anthocyanidin 68.4±1.9＊△ 13.3±1.4＊△ 14.5±0.8△ 3.5±0.8 Control△

2.4 各组EVC304细胞caspase-3活性 EVC304细胞经过微波辐射后，由于细胞发生凋亡，caspase-3 活性变为 0.458，明 显高于对照 组（0.245） （P＜0.05）。而微波辐射后加入25、50和100mg·L－13个浓度的越橘花色苷，细胞的 caspase-3 活 性 分 别 降 至 0.407、0.388 和0.285，与微波辐射组比较明显下降（P＜0.05）。

3 讨 论

花色苷是越橘果实中的主要成分，具有抗氧化、抗突变、预防心血管疾病、抗疲劳、抗衰老和抗辐射等功能，在食品和医药方面显示出潜在的应用潜力[10－11]。目前，美国和日本将越橘提取物做成锭剂胶囊和颗粒等保健食品，北欧一些国家将野生越橘制成药品，且很多药品均已商品化。虽然我国有丰富的越橘资源，但是缺少高附加值的越橘产品，因此对越橘花色苷的功能产品的开发极具市场应用价值。提取是分离纯化和利用花色苷的重要环节，本研究为了提高花色苷的产量，选择了微波辅助提取法，在最优提取条件下使得花色苷的产量达到了0.402mg·g－1（湿重）。微波具有选择性高、加热效率高和对植物细胞破壁能力强等特点，在分析方面体现了操作简便、快速和高效的优点，在实际生产过程中具有安全、节能的潜力。

越橘花色苷具有抗辐射作用[12－14]，但是关于这方面的具体研究并不多。本研究探讨了越橘花色苷对血管内皮细胞EVC 304辐射损伤的保护作用，为越橘花色苷今后作为抗辐射药物的研究奠定了基础。本研究结果表明：20mW·cm－2强度微波辐射EVC 304细胞20min，微波辐射作用后24h，细胞的增殖活性受到明显的抑制，增殖抑制率达到58.6%。而花色苷组细胞增殖活性明显提高，100mg·L－1的浓度时，微波辐射对EVC 304细胞增殖抑制率为30.5%，说明越橘花色苷对细胞辐射损伤具有一定的保护作用。倒置显微镜下观察细胞形态，结果显示：辐射损伤组细胞出现收缩、变圆和体积变小，细胞间隙增宽，大部分细胞出现破碎、脱落的现象。不同剂量的花色苷组细胞形态比微波辐射组有所改善。

本实验观察微波辐射后EVC 304细胞周期的变化发现：微波辐射后凋亡是细胞死亡的主要形式，而花色苷组细胞的凋亡率明显下降，G2/M期细胞比例高于微波辐射组，但并不明显。细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡[15－16]。caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能[17－19]。在凋亡的早期阶段被激活，可裂解相应的胞质胞核底物，执行凋亡功能。本研究实验结果表明：微波辐射组细胞的caspase-3活性升高，说明细胞发生了凋亡，而微波辐射组与花色苷组比较细胞活性明显降低，进一步说明越橘花色苷对辐射损伤细胞有保护作用，但是对微波辐射的保护机制尚需进一步的深入研究。

综上所述，花色苷是越橘果实的主要成分，通过微波辅助的方法能够提高花色苷的提取产率，为进一步深入研究其活性奠定了物质基础。此外，对EVC304细胞的辐射保护作用也证明了越橘花色苷在辐射保护中的作用，结合提取工艺，可为越橘花色苷的开发利用提供理论依据。

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