番茄突变体jai1-1高效筛选—再生体系的建立

范锡麟，王少岭，肖应辉，王志龙

(湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室/湖南农业大学农学院，长沙410128)

番茄是茄科(Solanaceae)番茄属(Lycopersicon)植物，其分布广泛，营养丰富，是一种重要的经济作物。一方面由于各种病虫害的发生，不同程度地影响着番茄的品质和产量，甚至造成巨大的经济损失［1］;另一方面，番茄基因组较小、遗传背景清楚、突变体材料丰富、易于遗传转化，是果实发育生物学研究的模式植物。研究发现，COI1基因编码一个F－box蛋白，是茉莉酸甲酯(MeJA)的受体，与Skp1－Cullin－Rbx1相互作用构成SCF复合物，参与植物胚胎发育、性别决定［2］、植物与病原菌的互作［3］、自交不亲和性［4］、细胞凋亡［5，6］、光信号途径及植物激素信号转导。拟南芥中COI突变体coi1-1对Me-JA不敏感，表现为花粉活力降低而导致雄性不育，并对病原菌的侵染易感，研究还发现COI1基因的异位表达能部分恢复花粉育性［7，8］;而番茄 COI1相似基因JAI1的突变体jai1-1表现为腺毛发育不全，花粉活力降低并表现出雌性不育，对棉叶螨敏感以及依赖于JA的基因表达的功能缺陷［9］。通过比对分析番茄、大豆、拟南芥和水稻中COI1同源基因的蛋白序列，发现其有很高的同源性，这暗示了COI1基因在进化上的保守性。实验室已克隆得到了大豆、番茄、拟南芥和水稻中的COI1同源基因，并构建了一整套用于研究COI1功能及信号通路的相关植物表达载体，通过农杆菌介导的方法转化番茄jai1-1突变体，希望从第三方的角度来了解基因在植物进化中的共性和特异性。本实验拟建立番茄突变体jai1-1的高效筛选—再生体系，以提高农杆菌介导的遗传转化效率，为后续番茄的遗传育种和功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

番茄野生型JAI1和含有突变体jai1-1的F2种子均由本实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 种子消毒

用浓度75%酒精消毒1 min，无菌水冲洗2次。再将种子用浓度为10%(m/v)的Ca(ClO)2溶液灭菌20 min。无菌水冲洗4～5次，无菌滤纸吸干后接种于1/2 MS固体培养基中。

1.2.2 培养条件

将接种好的种子和子叶及下胚轴置于组培室中，26℃恒温培养，光照强度为2 000～2 500 lx，光周期为14 h。

1.2.3 jai1-1突变的筛选

待种子萌发至约1 cm时，转移至含有不同浓度JA(茉莉酸)的1/2 MS固体培养基中进行筛选，5 d后选取根部能正常生长的种子重新接回不添加任何激素的1/2 MS固体培养基中，作为进一步实验的材料，其他种子直接种植于营养土中。

1.2.4 愈伤组织的诱导及不定芽的分化

以番茄幼嫩子叶和下胚轴作为实验材料。在第1片真叶长出前，切去番茄子叶的尖端和底部，将子叶二分，切成约0.5 cm×0.5 cm的外植体，子叶上表皮朝下倒置接种于诱导培养基中［10］;下胚轴中段切成约1 cm的长度，接种于不同激素组合的诱导培养基中(表1)，每个培养皿接种10个，每种培养基接 3 个重复，每隔两周进行一次继代培养［11，12］，30 d后观察并记录实验结果。

表1 不同处理的诱导培养基激素组合

1.2.5 不定根的诱导

待幼芽长至2.0～3.0 cm，3～4片叶时，选取长势良好，生长健壮的芽体，切除基部愈伤组织及培养基，转接至添加有不同激素组合的生根培养基中诱导生根(表5)，每瓶接种4～5个幼芽，一周后观察并记录实验结果。

1.2.6 试管苗移栽

待试管苗根系发达，长至6～8 cm高时，打开瓶口，保湿后置于组培室中。5～7 d后取出试管苗，洗去根部残余培养基后移栽到装有营养土的花钵中，浇适量水待其正常生长成植株。

1.2.7 基因型鉴定

采用CTAB法提取经组织培养形成植株的番茄叶片DNA，设计基因特异性引物PCR，鉴定不同浓度MeJA对jai1-1突变体的筛选效果［9］。

F1:5'－ GTGGAGACGATATGTTGAGACTAA－3'

F2:5'－ CCATGGAGTCCATCACCTAACAGT－3'

F3:5'－ GTGGTCAGATCAGAGCCCTCTATT－3'

分别以F1、F2和F1、F3为引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。10 μL PCR反应体系:DNA 1 μL，上游引物(10 μM)1 μL，下游引物(10 μM)1 μL，10 × Buffer 1 μL，dNTPs 0.2 μL，rTaq 0.1 μL，ddH2O 5.7 μL。

反应程序为:95℃预变性5 min;每个循环条件为:95℃变性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，共进行35个循环;72℃终延伸10 min;反应结束于16℃保存。PCR产物用1%琼脂糖电泳检测。

2 结果与分析

2.1 不同MeJA浓度对jai1-1突变体的筛选

由于番茄jai1-1突变体表现为雌性不育而不能正常结实，因此只能从F2群体中分离得到。以JAI1种子作为对照组，在不添加MeJA的1/2 MS固体培养基中，全部种子都能正常生长;以F2群体种子作为实验组，一部分不经过MeJA处理，发现其能够正常生长;另一部分用不同浓度MeJA处理，发现只有极少数种子对MeJA不敏感，其生长不受影响，表现出与对照组一致的生长状态，其基因型应为jai1-1;而大部分种子的生长都受到明显抑制，具体表现为下胚轴和子叶较正常组短小，胚根基部呈紫红色，生长缓慢，其基因型应为JAI1和JAI1/jai1-1。其中，实验组在含100 μM/L MeJA的筛选培养基中，抑制效果最为明显，后将其转移至诱导培养基中，发现愈伤组织的诱导和不定芽的分化都明显低于其他组合。

表2 不同MeJA浓度对jai1-1的筛选效果

2.2 不同诱导培养基对愈伤组织诱导的影响

JAI1和jai1-1 两个番茄品种的子叶和下胚轴在表1所列的诱导培养基中都能诱导出愈伤组织。下胚轴在7 d左右可形成愈伤组织，且下胚轴诱导的愈伤组织增殖旺盛，生长快。实验发现，下胚轴诱导的愈伤组织表现出明显的极性，形态学上端的愈伤组织出现早，生长快，分裂旺盛;形态学下端的只形成少量愈伤组织，且生长缓慢，几乎不进行增殖分化。其中，处理7和处理8中诱导的愈伤组织生长最快，组织致密，呈白色或乳白色，经继代培养后只进行分裂增殖并逐渐褐化，丧失进一步的分裂生长能力。其他激素组合的培养基中诱导的愈伤组织生长相对较慢，组织较稀疏，经继代后表面逐渐形成绿色颗粒状突起，进一步分化出不定芽并形成完整的植株。

2.3 不同激素组合及不同外植体对不定芽分化的影响

表3 不同激素组合诱导子叶不定芽分化率的比较

表4 不同激素组合诱导下胚轴不定芽分化率的比较

实验发现，不同类型番茄外植体对不定芽的分化有显著影响。其中，下胚轴诱导的愈伤组织比子叶生长的快，但不定芽分化率低(表3和表4)。其中部分芽体生长慢，畸形芽比例高，失去进一步的分化能力。含2，4－D(处理7和处理8)培养基中诱导的愈伤组织经继代后表面形成白色的致密组织，生长极其缓慢，无法分化出不定芽。继代时将2，4－D变换为IAA或NAA，愈伤组织逐渐褐化死亡，无不定芽的分化。有研究认为2，4－D能强烈抑制胚胎发生的基因程序表达［13，14］，降低内源IAA的含量，抑制不定芽的分化。在含有ZT和IAA以及6-BA和IAA组合的培养基中，愈伤组织的诱导率都接近100%，且6-BA和IAA的激素组合形成愈伤的速度较ZT和IAA组合快，但后期的分化率较低，并表现为明显的时序性，即先形成大量愈伤，再在愈伤组织表面形成绿色组织，进一步形成芽原基直至分化出不定芽。而ZT和IAA组合愈伤组织的诱导和不定芽的分化几乎是同步的，在形成少量愈伤组织的同时就会诱导不定芽的分化，且芽体生长速度快，畸形芽比例低。而下胚轴不定芽的诱导表现出明显的极性，形态学上端不定芽分化早，生长快;形态学下端愈伤生长缓慢，几乎不诱导形成不定芽。相同条件下子叶诱导不定芽的效率明显高于下胚轴，且分化系数较高，芽体生长较快，畸形芽比例较低。另外，激素诱导愈伤组织和不定芽分化也表现出一定的基因型依赖性［15，16］。jai1-1子叶和下胚轴诱导愈伤的生长速度明显慢于JAI1，芽体数量、分化率也明显低于JAI1。在继代培养过程中有的芽体因畸形芽比例偏高而无法正常生长，因此，不定芽分化过程中，保证芽体数量和芽体的正常生长是关键。实验结果表明，对于JAI1，处理5和处理6中诱导不定芽的分化率无明显差别;而对于jai1-1，子叶和下胚轴诱导不定芽分化的最佳培养基为MS+ZT 2.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L。

2.4 不同激素组合对生根的影响

在添加有NAA的培养基中生根迅速，5～6 d后可见愈伤组织基部膨大长出幼根，10 d左右不定根数目增多，并很快长出侧根，幼苗生长旺盛。而在添加有IAA的培养基中生根相对较慢，不定根数目较少，根细且长，幼苗生长相对缓慢。且JAI1和jai1-1在添加有NAA 0.1 mg/L和NAA 0.2 mg/L的两种生根培养基中的生根效果无明显差异(表5)。

表5 不同激素组合诱导生根的效果比较

2.5 PCR检测结果

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，1 号为空白对照;5，9，11，13，14 和19 号番茄基因组DNA只能扩增出大小约为500 bp的条带，应为JAI1;2，16和20号只能扩增出大小约为750 bp的条带，应为 jai1-1;6，7，8，10，12，15，17，21 和 22 号则能扩增出500 bp和750 bp大小的两条带，应为JAI1/jai1-1杂合子，这与实验预期完全相符;而3号和4号未扩增出目的条带，可能是提取的DNA质量较差所致。结果发现，经MeJA筛选后的材料全部表现为jai1-1基因型，且表现为JAI1和JAI1/jai1-1基因型的都是经MeJA筛选敏感而直接种植于营养土中的材料。说明通过这种方法建立起了番茄突变体jai1-1的高效筛选—再生体系。

图1 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测

3 结论与讨论

实验发现，番茄愈伤组织在继代培养过程中往往容易发生褐化，为防止愈伤组织褐化，保持旺盛的增殖分化能力，应缩短继代时间的间隔。也可在继代培养时加入一定浓度的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、抗坏血酸或活性炭［17］。有研究认为黑暗或弱光处理也能显著降低褐化程度，但会影响不定芽的分化和光的形态建成。

实验结果表明，ZT和IAA的激素组合诱导子叶和下胚轴产生不定芽的分化率明显高于6-BA和IAA的组合，在相同条件下子叶诱导不定芽的分化率明显高于下胚轴。相同条件下，jai1-1不定芽的诱导率又明显低于JAI1。原因可能是jai1-1是突变体，JAI1基因编码的蛋白COI1是茉莉酸甲酯MeJA的受体，其可能因JA信号转导途径的缺陷而表现出对某些激素的超敏或者不敏感［18，19］。实验发现，1/2 MS+50 μM/L MeJA是突变体jai1-1筛选的有效培养基。野生型JAI1和突变体jai1-1在MS+6-BA 2.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L诱导愈伤组织的效果最好;JAI1在MS+ZT 1.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L诱导分化不定芽的效率最高，而jai1-1则以MS+ZT 2.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L为佳;1/2 MS+NAA 0.1 mg/L是两者诱导生根的理想培养基。实验还发现，JAI1和JAI1/jai1-1与jai1-1的比例严重偏离3∶1的理论值，大致上为8∶1～12∶1，这可能与受精作用及胚胎发育的缺陷有关。在植株发育成苗的过程中，jai1-1突变体生长较慢，植株瘦小细长，叶片小且薄，植株能够正常开花但不能正常结实，有极少数能够正常结实的其果实也比野生型小很多，且没有正常的种子。以本实验探索得到的番茄最佳离体再生体系为基础，可以将COI基因引入到番茄育种中，提高番茄品种对生物胁迫和非生物胁迫的抗性。下一步将以jai1-1突变体为材料，对番茄茉莉酸甲酯受体基因COI以及JA的信号转导途径进行深入研究。

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