野生和半人工养殖东北林蛙生长发育的比较

周学红 杨锡涛 吴 丹

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

东北林蛙(Rana chensinensis)的雌性输卵管(哈什蟆油)具有药用价值，因而被广泛养殖。其养殖方式分为半人工养殖和全人工养殖两种:半人工养殖，指在蛙卵孵化以及幼蛙变态前进行人工管理(包括蝌蚪的繁育、饲喂、疾病防控等)，幼蛙上山后人为干预较少，完全生活在野生环境中;全人工养殖(圈养)，指从野生环境中获取蛙卵，在人工环境中进行孵化、变态，成蛙进行人工饲喂活体昆虫饲料、进行人为管理，人工提供冬眠环境，但这种养殖方式尚处在探索研究与实践中。在我国，东北林蛙的养殖以半人工养殖为主，技术也相对比较成熟。从目前的情况看，林蛙的人工养殖，不仅有利于野生种群的恢复和生态平衡的维持，而且有利于当地经济的发展[1-5]。

两栖类动物，由于食物资源、营养状况和代谢水平的季节周期性差异，使其生长出现快速发育期、缓慢发育期和停滞期的周期性变化。骨骼组织生长过程中，骨胶原纤维和矿物质积累的不同，使得骨组织疏密程度不同，从而出现周期性生长的抑制生长线(LAG)。LAG一般在食物短缺的冬眠期间形成，因此骨骼上的每一条LAG对应相应年份的冬眠期。某一个体骨骼切片上LAG的分布规律，可以获得该个体的生长发育情况;而群体的骨骼切片上LAG的生长规律，可以反映出群体的总体情况，甚至可以推测出每个个体若干年后的生长发育变化的动态信息。骨龄学研究方法，是基于动物骨骼切片上可数的LAG进行年龄结构分析，可以得出物种的平均寿命、性成熟年龄及生长速率等，因而这一方法被广泛的应用于两栖类的研究中[6-12]。

野生与半人工养殖状态下，林蛙的外部形态特征或内部组织器官的生长，存在一定的差异。为了研究人工因素对林蛙生长发育的作用，本文应用骨龄学方法，比较了野生和半人工养殖林蛙发育的差异性。在对野生和半人工养殖林蛙进行年龄鉴定的基础上，对林蛙的体长、体质量、趾骨直径、生长速率和趾骨切面的各LAG直径的相对生长速率进行了差异性比较;并进一步研究了东北林蛙半人工养殖条件下，人为因素对林蛙生长发育的影响。

1 材料与方法

2010年10月份，在吉林省长白山地区半人工养殖区域的采样地 1(N42°20'，E128°09')和采样地2(N42°14'，E128°10')取林蛙共 184 只(雄蛙 89 只，雌蛙95只)，在距半人工养殖区域不远处的样地3(N42°21'，E128°05')取野生林蛙 125 只(雄蛙 56只，雌蛙69只)。

每个采样地各取40个样方(1 m×1 m)，每隔200 m取1个，调查草本盖度、落叶层厚度和郁闭度，同时收集林蛙半人工养殖户饲养管理信息，如饲料配方、水温调控方法等。

将林蛙带回实验室后，滤纸擦拭林蛙，电子天平称其活体体质量，精确至0.01 g;游标卡尺测量其体长(从吻端至泄殖孔缘的距离)，精确至0.02 mm;根据拇指是否有婚垫进行性别区分。林蛙右后腿第三趾骨的第二骨块离体标号后，去除皮肤肌肉组织，用10%的生理甲醛溶液固定2 h，10%的生理硝酸溶液脱钙36 h，流水冲洗24 h。50%、75%、85%、95%和100%的乙醇梯度脱水各80 min，二甲苯乙醇溶液(体积比1∶1)、二甲苯溶液中透明2次各30 min，二甲苯石蜡溶液(体积比1∶1)中1 h以除去二甲苯，石蜡油中2次(每次15 min)以进一步除去二甲苯，石蜡包埋。用手摇切片机把骨块切成7 μm，二甲苯溶液脱蜡2次，100%、95%、75%、50%的乙醇溶液复水各3 min，恒温箱内(50℃)Ehrlich酸性苏木精溶液染色1 h。切片在20倍物镜下，由两人确定LAG的数目。用精度为1 μm的显微测微尺测量各个LAG的最大直径和最小直径，其几何平均数作为 LAG 的直径[13]。

林蛙生长速率的计算参照von Bertalanffy’s方程，St=Sm-(Sm-S0)e-k(t-t0)。式中:St为 t年龄时的体长，Sm为最大体长，S0为变态时的体长(12 mm)，t0为变态时的年龄(0.125 a)，k为增长速率。

建立林蛙趾骨LAG直径相对增长率的计算方法:设林蛙的年龄(t)与趾骨LAG直径(R)具有函数关系f(t)，趾骨LAG直径的相对增长率为r，且在Δt的时间内，r值变化很小，由于趾骨的生长连续性(即f(t)可微)，变态时林蛙年龄为t0，则f(t0)=R0。由假设得，对任意时间 Δt＞0，都有[t，t+Δt]，LAG 直径的增量为f(t+Δt)-f(t)。由微分定义得:[f(t+Δt)-f(t)]/Δt=rf(t)，令 Δt→0，得微分方程 dy/dt=rf(t)，求积分得f(t)=R0ert。可得LAGn对 LAGn-1的相对增长率为r=ln[f(t)/f(t-1)]。

对野生和半人工养殖林蛙的体长、体质量、趾骨直径和趾骨LAG直径相对生长速率的均值进行两独立样本t检验，用SPSS16.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 年龄鉴定

根据前期研究工作可知[13]，在野生林蛙中共25个样本(20%)、养殖林蛙中共31个样本(16.85%)存在重吸收和LAG模糊现象，这些个体不参与统计分析，同时把林蛙分成6个年龄组(见表1)。

表1 各年龄段林蛙样本分布表 只

2.2 林蛙生长发育情况的比较

两栖类生长发育过程中，各组织器官之间的发育具有关联性，可以利用某器官的生长状态来反映个体的发育情况。由于骨骼生长的特殊性，LAG的规律性变化可以反映出林蛙生长发育的情况。通过线性回归分析(见表2)得出:林蛙的体长与趾骨直径、体长与体质量间存在较强的相关性(p＜0.001)，体长、体质量随趾骨直径的增加而呈相应的规律性增加，因此可利用趾骨的生长情况来衡量林蛙个体的生长情况。

表2 林蛙体长与趾骨直径、体质量的相关性

对野生和半人工养殖林蛙的体长、体质量、趾骨直径均值进行两独立样本t检验后，得出(见表3):无论雌雄，野生林蛙的体长、体质量均值，都显著小于半人工养殖林蛙的(p＜0.05);野生林蛙的趾骨直径小于半人工养殖林蛙的，但差异不显著(p＞0.1)。

2.3 林蛙生长速率比较

从林蛙种群的自然生长速率可以推断出种群的生长情况，可进一步反映林蛙各个时期的生长特点。由von Bertalanffy’s方程得到林蛙生长速率和最大体长(见表4)。在95%的检验水平下，无论是野生种群还是半人工养殖种群，雌蛙的生长速率小于雄蛙的生长速率(见图1、图2)。雌性半人工养殖林蛙的生长率均大于雌性野生林蛙的生长率，雄性半人工养殖林蛙的生长率大于雄性野生林蛙的生长率。

表3 体质量、体长、趾骨直径差异比较

表4 林蛙生长速率(k)、最大体长(Sm)值的比较

图1 野生林蛙年龄与体长的关系

2.4 林蛙趾骨LAG直径相对生长速率的比较

林蛙个体趾骨LAG的生长可以反映出营养对趾骨的生长作用，群体骨骼LAG的生长规律可以推测出群体生长发育的动态变化。为了比较野生和半人工因素对其生长的影响，对林蛙趾骨LAG直径的相对生长速率的均值进行了两独立样本t检验(见表5)。2龄半人工养殖林蛙的LAG2对LAG1的相对生长速率大于2龄野生林蛙的(P=0.095＜0.1);3龄～5龄半人工养殖林蛙的LAG2对LAG1的相对生长速率也大于野生林蛙的。由此可知，人工因素的干扰对幼趾骨生长作用较大。相同年龄组的林蛙，LAGn对LAGn-1的相对生长速率，半人工养殖林蛙的均大于野生林蛙的;最外层LAG直径对次外层LAG直径的相对生长速率，半人工养殖林蛙的也大于野生林蛙的;由此证明，上年趾骨的生长影响了下一年趾骨的发育。

图2 半人工养殖林蛙年龄与体长的关系

表5 林蛙趾骨LAGn对LAGn-1的相对生长速率

2.5 采样地自然环境比较

林蛙的生长发育等受环境因子的影响比较大，采用样方法对3个采样地的草本盖度、郁闭度和落叶层厚度调查结果(见表6)可知，半人工养殖区域内(采样地1、采样地2)的落叶层厚度无显著差异(P=0.644)。但草本盖度及郁闭度差异极显著(P=0.001，P=0)。

表6 采样地草本盖度、郁闭度、落叶层厚度比较

3 讨论

在半人工养殖环境中，虽然林蛙生活在野生自然环境中，但是半人工的饲养管理的作用，在一定成度上使得林蛙体长、体质量和生长速率等与野生林蛙的存在着差异性。本研究结果表明:半人工养殖林蛙的体长、体质量、生长速率和趾骨LAG直径相对生长速率，均大于野生林蛙的。

半人工养殖林蛙的生长优于野生林蛙的因素，主要来源三方面:政府政策、林蛙生活自然环境和人工饲养管理。

3.1 政府政策的积极作用

在我国，为了既促进林蛙野生资源的保护，又满足社会对林蛙的需求，各级政府公布林蛙饲养管理的法律法规(如白山市林蛙养殖经营管理暂行规定、吉林长白山中国林蛙油质量鉴定标准等)，并采取林蛙养殖区域承包责任制(部分养殖区域承包年限在10 a左右，有的甚至是终生承包);中国养殖协会定期开展林蛙饲养管理技术培训。林蛙养殖投资少，收益大，采样养殖户2008、2009年的年均收入10000元左右，而吉林省农民2008、2009年的年均收入分别是4932元和5265元(2010年中国统计年鉴)，提高了养殖户的积极性，从而加大了对林蛙的饲养管理，促进了林蛙养殖业的发展。

3.2 林蛙生活环境的影响

对采样地自然环境调查结果表明，植被类型均为针阔混交林，虽然野生林蛙生活的森林郁闭度与人工养殖区域相差无几，但草本盖度和落叶层厚度小于半人工养殖区域的(见表6)。半人工养殖林蛙生活的自然环境优于野生林蛙生活的自然环境，这与半人工养殖区域承包到个人，有效地促进了养殖户对承包区域内植被的保护有关。自然环境是影响林蛙生长发育的因素之一，这一观点与刘欣[14]、邱宝鸿[15]相同;张利萍[16]认为，对林蛙分布影响最大的是林分类型，其次是落叶层厚度。林分类型决定了落叶层的厚度，而厚度利于林蛙躲避天敌和节肢动物的生存，为林蛙提供足量的食物，从而促进了林蛙的生长。

3.3 林蛙饲养管理的影响

林蛙的半人工养殖，蝌蚪期的管理至关重要，不仅影响蝌蚪的成活率和体质体况等，还关系到幼蛙的成活率和性成熟的早晚;因此，蝌蚪变态前的体质量是衡量其发育是否良好的主要标准之一，体质量越大，变态幼蛙的体质量也越大，越有利于幼蛙以后的生长发育[3]。影响林蛙蝌蚪生长发育的因素包括营养、温度和密度等[17]。

林蛙蝌蚪在不同的生长阶段，对食物和营养的需求各不相同。蒋朝光[18]认为，蛋白质总供量是制约林蛙发育历程的主要因素，只要满足了一定量的总蛋白，即使饲料单一，也不会影响林蛙的发育;崔明勋[17]报道了动物性饲料更有利于林蛙蝌蚪的生长发育。而霍洪亮[19]认为，植物性饲料和动物性饲料的混合饲料更能加快蝌蚪的发育;卫功庆[20]、王忠艳[21]、田秀华[3]的实验结果也证明了，混合性饲料较单纯植物性饲料和单纯动物性饲料更有利于蝌蚪生长发育。因此，食物营养是蝌蚪成活率的限制因子，也影响着蝌蚪的变态率和幼蛙的成活率[17]。如果饲料或营养不足，蝌蚪互食，生长缓慢;饲料或营养过剩，易造成饲料浪费、蝌蚪不变态。实践中，林蛙养殖户在蝌蚪期会适量的添加由食盐、玉米面、青菜叶和少量动物内脏等组成的混合饲料，以保证蝌蚪发育的营养需要。

但是，温度在一定程度上也影响了林蛙的生长发育。崔明勋[17]、王立志[22]报道了林蛙蝌蚪生长的适宜温度为25℃，在此温度下，蝌蚪的体质量和变态率是最高的;而温度过低，蝌蚪生长缓慢，过高则会使水体缺氧、性比失衡，出现雄多雌少的现象。实践中，养殖户通过在变态池底铺塑料膜，在池边放置树枝或采用进出水的方法来调节温度。

4 结论

半人工养殖林蛙的体长、体质量均值都极显著的大于野生林蛙的，半人工养殖林蛙的趾骨直径大于野生林蛙的，但差异不显著;由von Bertalanffy's方程得到半人工养殖林蛙的k值大于野生林蛙的;由林蛙趾骨直径相对增长率的计算方程可知，相同年龄组的林蛙的LAGn对LAGn-1的相对生长速率，半人工养殖林蛙的大于野生林蛙的。半人工养殖林蛙生长发育优于野生林蛙的因素，包括政府政策、生活环境和饲养管理3个方面。引起半人工养殖林蛙与野生林蛙生长的差异性，除上述因素外，是否与种源、遗传等因素有关，有待进一步的研究。

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