抗乳增片对乳腺增生症大鼠T细胞亚群及免疫分子的影响

周 会， 汪天明， 王 靓， 胡海霞， 白 玫

(安徽中医药大学中西医结合临床学院，安徽合肥230038)

现代研究表明，乳腺增生症除了表现为内分泌激素失调外，还可表现为免疫分子及免疫细胞等含量及功能的异常。神经、免疫和内分泌系统在维护机体内环境的平衡中相互协调，组成信息分子相互调节的统一整体［1-2］。本实验通过复制大鼠乳腺增生模型，考察抗乳增片对乳腺增生症大鼠免疫系统的影响，进一步探讨抗乳增片对大鼠乳腺增生的治疗机理。

1 实验材料

1.1 实验动物 普通级SD雌性未孕大鼠36只，体质量(250±16)g，由安徽医科大学实验动物研究中心提供。

1.2 实验药物 抗乳增片:安徽医药研究所提供;主要药物:丹参、玄参、红花、柴胡、香附、当归、夏枯草、生牡蛎、山慈菇、海藻等。逍遥丸:湖南九芝堂股份有限公司，批号:090560;苯甲酸雌二醇注射液:上海通用药业股份有限公司生产，批号:030402;红细胞裂解液由美国kegene公司提供;流式细胞仪:EPICSELITE(美国B-C公司)。IL-2，TNF-α试剂盒购于解放军总医院东亚免疫所;T细胞亚群试剂盒购于北京博奥森生物技术有限公司 (抗体:PE标记的小鼠抗大鼠CD4+抗体，TC标记的小鼠抗大鼠CD8+抗体，FITC标记的小鼠抗大鼠CD3+抗体，以上抗体原产于美国CALTAG公司)。

2 实验方法

2.1 大鼠乳腺增生模型的制备 SD雌性未孕大鼠36只，随机分为6组:假手术组、模型对照组、阳性对照组和抗乳增片大、中、小剂量组。10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，剂量为0.3 mL/100 g体质量。假手术组的大鼠不摘除卵巢，打开腹腔后重新缝合;其余各组的大鼠均摘除两侧卵巢。除了假手术组以外，其余各组大鼠于手术后第2天起隔天腹腔注射苯甲酸雌二醇 (剂量为0.3 mg/kg体质量)，连续15次，制造乳腺增生模型［3］。

2.2 给药 造模后假手术组和模型组给予蒸馏水，灌胃。给药组给药容积均为10 mL/kg;抗乳增片大、中、小剂量组给予抗乳增片，剂量分别为2.34、0.78、0.26 g/kg体质量;阳性对照组给予逍遥丸，剂量为2.28 g/kg体质量。以上给药连续4周，每日1次。

2.3 观察指标 给药4周后，腹主动脉放血处死大鼠。留取血液5 mL，2 mL立即离心 (3 000 r/min，5 min)制备血清，用放射免疫方法测定各组实验性大鼠血清中IL-2和TNF-α的水平［3］。其余用于检测T细胞亚群，取100μL血液置于EDTANa2抗凝管中，加入CD3+抗体、CD4+抗体和CD8+抗体。室温下避光孵育30 min，加红细胞裂解液3 mL，放置10 min后，1 500 r/min离心10 min，弃去上清液。PBS洗涤，1 500 r/min离心10 min，弃去上清液，上流式细胞仪检测T细胞亚群［4］。

3 实验结果

3.1 抗乳增片对大鼠血清中IL-2和TNF的影响 如表1，模型组大鼠血清中的TNF-α显著高于假手术组，IL-2却低于假手术组 (P＜0.05)。经抗乳增片治疗组各鼠血清中IL-2显著高于模型组而TNF-α显著降低 (P＜0.05)。各剂量组之间的上述两项指标无显著差异 (P＞0.05)。

表1 抗乳增片对大鼠血清中IL-2和TNF-α的影响 (±s，n=6)

表1 抗乳增片对大鼠血清中IL-2和TNF-α的影响 (±s，n=6)

注:与模型组相比较:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

分组 剂量/(g·kg－1)IL-2/(ng·mL－1)TNF-α/(ng·mL－1)假手术组 0.29±0.10＊＊ 1.58±0.26＊＊模型组 / 0.16±0.08 1.99±0.36抗乳增片大剂量组 2.34 0.32±0.09＊＊ 1.47±0.21*抗乳增片中剂量组 0.78 0.42±0.12＊＊ 1.48±0.03*抗乳增片小剂量组 0.26 0.31±0.07* 1.56±0.42逍遥丸组 2.28 0.27±0.07＊＊ 1.10±0.36＊＊

3.2 抗乳增片对大鼠外周血中T细胞亚群的影响 流式细胞仪检测模型对照组大鼠CD3+、CD4+、CD4+/CD8+显著低于假手术组(P＜0.05)，CD8+较假手术组稍高但无显著性差异。抗乳增片治疗组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+等指标有所提高，尤其是大剂量组上述指标与模型对照组有极显著差异 (P＜0.01)，抗乳增片中剂量组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+等指标较模型组亦有所上调(P＜0.05)(见表2)。

表2 抗乳增片对大鼠血清中T细胞亚群的影响 (±s，n=6)

表2 抗乳增片对大鼠血清中T细胞亚群的影响 (±s，n=6)

注:与模型组相比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

分 组 剂量/(g·kg－1) CD3+/% CD4+/% CD8+/% (CD4+/CD8+)假手术组 / 61.67±14．66* 32.70±4.77* 22.59±4.66 1.53±0.50*模型组 / 48.46±13．77 24.27±6.39 24.58±2.05 1.00±0.30抗乳增片大剂量组 2.34 63.94±10．30＊＊ 37.61±8.01＊＊ 32.27±4.41＊＊ 1.18±0.29抗乳增片中剂量组 0.78 63.79±6．48* 36.67±4.05＊＊ 26.12±4.85 1.44±0.03*抗乳增片小剂量组 0.26 59.71±5．53 30.25±3.30* 26.11±4.46 1.16±0.11逍遥丸组 2.28 59.48±10．62 33.26±6.79*27.78±8.63 1.31±0.54

4 讨论

现代医学认为乳腺增生的发病是内分泌的紊乱所引起，雌二醇分泌绝对或相对过高，孕酮水平低，以致月经周期中乳腺组织增生和复旧过程发生紊乱，使乳腺导管或腺泡上皮增生，乳管扩张成囊状，形成肿块［5-7］。研究表明T淋巴细胞是性激素的主要靶器官，雌二醇、孕酮分泌紊乱可导致机体自体免疫调节网络系统呈现免疫抑制状态及免疫调节功能的紊乱，出现免疫功能降低，免疫系统不能有效的识别、抑制和清除病变细胞而导致本病的发生。正常机体内体内CD3+(T辅助细胞)、CD4+(T抑制)细胞维持一定的比例，各淋巴细胞亚群相互作用，维持机体正常的免疫功能［8-9］。临床研究发现，乳腺增生患者体内CD3+、CD4+水平稍低于正常值、CD4+/CD8+显著低于正常值［10］。本实验发现模型组大鼠CD4+/CD8+值降低显著，CD3+、CD4+T细胞百分数亦有不同程度降低。CD4+/CD8+值发生改变说明乳腺增生模型大鼠淋巴细胞及其亚群在变化之中，机体免疫功能发生了紊乱，与报道一致。经抗乳增片治疗的大鼠血清CD4+/CD8+值明显上调，CD3+、CD4+T细胞百分数亦有所提高。

临床研究也发现乳腺增生病患者免疫功能失调，与免疫相关的细胞因子如IL-2，TNF等参与机体的免疫调节。IL-2是由活化的TH1细胞或CD4+细胞产生，主要通过自分泌方式促进T细胞生长，可诱导杀伤异常增生细胞;TNF-α具有抗感染、抗病毒和抗肿瘤的作用［11］。本研究中模型组大鼠血清中的 TNF-α显著高于假手术组 (P＜0.05)，IL-2却低于假手术组 (P＜0.05)。经抗乳增片治疗组各鼠血清中IL-2显著高于模型组而TNF-α显著降低。表明抗乳增片能够促进IL-2生成，抑制TNF-α的合成，对大鼠免疫系统具有一定的调节作用。

现代研究证实柴胡、香附、当归等具有疏肝解郁、调节内分泌、增强机体免疫功能的作用，王桐生等报道香附可显著提高小鼠吞噬指数，脾脏胸腺指数，增加脾脏淋巴细胞的增殖活化［12］。夏枯草、生牡蛎、山慈菇、海藻等则着重散结化痰通络。红花、丹参等中药可活血祛瘀、调节免疫，抑制血小板聚集、改善微循环、抗肿瘤等作用。通过本实验研究提示抗乳增片解郁散结，调节免疫之功，可能是通过调节T淋巴细胞亚群及IL-2、TNF-α等免疫分子的水平而实现的。对抗乳增片的前期的实验研究中也发现模型组大鼠，脾脏指数、胸腺指数较假手术组均降低，抗乳增片治疗组的脾脏、胸腺等免疫器官脏器指数显著升高［13］。抗乳增片能有效提高乳腺增生大鼠的免疫功能，这可能是其抑制大鼠乳腺组织病变的另一机理。

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