小白菊内酯抗肿瘤作用机制研究进展

徐惠君， 佟仲生*， 贾勇圣， 陈 悦

(1.天津医科大学附属肿瘤医院乳腺肿瘤内科，乳腺癌防治教育部重点实验室天津市肿瘤防治重点实验室，天津300060;2.南开大学药学院，天津300071)

小白菊内酯 (Parthenolide)是中药野生甘菊 (银胶菊属银胶菊Parthenium hysterophorus)的主要提取成分，它是倍半萜烯内酯的主要成分［1］。小白菊内酯的分子式为C15H20O3(化学结构式见图1)，相对分子质量为248.3，小白菊内酯含有α－亚甲基－γ－内酯环和环氧化物结构［2］，这些结构可以和含有巯基基团的酶和其它功能蛋白反应，干扰细胞的许多关键生物过程，如细胞的信号传导途径，线粒体呼吸，增殖和凋亡等［3］。这些反应可降低酶的活性，改变谷胱甘肽 (GSH)的代谢并引起细胞内氧化还原平衡状态的严重失衡。小白菊内酯的环氧亚甲基结构使其具有细胞毒性。

图1 小白菊内酯的化学结构

小白菊内酯传统上主要用来治疗偏头痛、发热和类风湿性关节炎等［4］。近年来研究发现小白菊内酯在多种肿瘤中发挥抗癌作用，如乳腺癌、胆管癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病、黑色素瘤和神经元［1，5－10］等，并成为研究的一个重要热点。许多研究发现小白菊内酯发挥抗肿瘤作用主要通过靶向作用于核转录因子－κB(NF－κB)［11］，产生活性氧(ROS)［2］，和活化c－Jun氨基端激酶(JNK)［12］等。

肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性，成为目前治疗失败的重要原因，Gao等研究发现小白菊内酯可以增强发生耐药的肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［13］，并且Zuch等研究发现小白菊内酯可以增加肿瘤细胞对放疗的敏感性［14］。这些结果使得小白菊内酯有望成为一种新的抗肿瘤药物。本文就小白菊内酯在抗肿瘤作用中的机制进行综述，以期进一步推动小白菊内酯在抗肿瘤作用中的研究和应用。

1 抑制NF-κB的信号通路

NF－κB是Rel/NF－κB转录因子家族可诱导的二聚化转录因子，主要由P50和P65两个多肽亚基构成。NF－κB在恶性肿瘤中起着重要的作用，主要包括控制凋亡，细胞增殖和分化，促进肿瘤细胞生存等［15］。NF－κB的活性受到多种水平的调节［16－19］。在多数种类的细胞中，NF－κB 由于被κB的抑制剂IκB抑制，在细胞质中以非活性的形式存在，直到受到相关的刺激作用而激活。细胞受到刺激后IκB激酶复合物(IκC)，包括IκKα，IκKß，和IκKy［20］，使 IκB磷酸化，进而发挥作用［21］。小白菊内酯对IκC的作用目前仍有些争议。Zhang等认为小白菊内酯可特异性地抑制IκK络合物的活性，序贯降解NF－κB抑制蛋白［20］。小白菊内酯二甲氨基类似物 (DMAPT)，它能抑制 NF－κß［9］，主要是IκKß，达到抗肿瘤作用。此外，Zuch等研究发现小白菊内酯对NF－κB途径诱导的细胞死亡依赖JNK的活化［14］。小白菊内酯抑制NF－κB的传导途径也可能通过对其他关键信号分子抑制完成的，如 P53［18］和环氧化酶－2(COX2)［19］等。并且，Sugiyasu等研究发现小白菊内酯可以通过抑制NF－κB信号通路，使得产生抵抗的肿瘤细胞对放疗敏感［22］。

2 抑制STATs活性

信号传导子及转录激活子 (STAT)蛋白是介导多种生物学作用 (细胞增殖、血管形成、细胞生存等)的胞外配体反应的转录因子［23］。目前，哺乳动物中已识别的STATs有 7 种:STAT－1， STAT－2，STAT－3， STAT－4， STAT－5a，STAT－5b和 STAT－6。STATs受到细胞因子或生长因子刺激发生二聚化作用，接着使酪氨酸磷酸化，并与DNA的特异位点结合调节基因。许多酪氨酸激酶，包括JAKs，TYKs，PTKs和其他非RTKs等可以使STATs磷酸化。正常细胞中，STATs的磷酸化是短暂的，持续时间约30 min至几个小时，在许多肿瘤细胞系中，STATs，尤其STAT3，发生持续的酪氨酸磷酸化，是由于解除STATs激活的阳性效应物，如其上游的酪氨酸激酶 (TYK)，或抑制STATs磷酸化的负性调节，如磷酸酶，细胞因子信号抑制剂 (SOCS)或活化的STATs蛋白抑制剂 (PIAS)［24］。STATs调节基因转录产物B淋巴细胞瘤－x基因 (Bcl－x)和存活素。这些产物使细胞增殖，抑制凋亡［25］。此外，小白菊内酯对STAT3结合的抑制可能抑制Tyr705磷酸化，使得STATs去磷酸化，不能形成二聚体，从而难以到达胞核中发挥生物学作用［26］。肿瘤坏死因子 (TNF)家族成员之一肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL)，诱导细胞表面受体 TNF－αR1和TNF－αR2发生三聚化，并与其结合，诱导细胞凋亡。Ivanov等研究发现STAT3的一个结合位点位于TRAIL－R2的启动区，而STAT3可能是TRAIL－R2的负性调节剂［27］。Carlisi等也通过研究发现小白菊内酯能明显降低STAT3和STAT5的磷酸化，使肝细胞对凋亡更加敏感。通过STAT3 siRNA下调STAT3，明显增加小白菊内酯对死亡受体的作用［26］。IL－4也是介导STATs信号途径的细胞因子，它刺激内皮细胞的STAT－6依赖的基因转录。在IL－4处理的细胞中，小白菊内酯抑制DNA结合的STAT－6活性，同时小白菊内酯抑制IL－4驱动的一种荧光素酶。该酶受STAT－6反应成分的控制［15］。此外Legendre等在关节软骨细胞中使用小白菊内酯作为STAT－1和STAT－3的抑制剂，证实了小白菊内酯对STATs活性的抑制［28］。

3 小白菊内酯介导的氧化应激作用及其对线粒体活性的影响

氧化应激指机体在遭受各种有害刺激时，体内ROS产生增多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而引起组织损伤。细胞内的氧化还原状态在氧化应激和内源性巯基缓冲系统间存在着极精确的平衡，该缓冲系统包括许多非蛋白的低分子量分子，如GSH和一些硫氧还原蛋白的巯基［15］。胞内的氧化还原状态，在细胞生存和死亡中起着重要的作用。许多化疗药物作为凋亡诱导剂，是因为它们可以减少细胞内的巯基缓冲系统，并且破坏氧化平衡状态［15］。细胞内不平衡的氧化还原状态可引发下游的细胞事件，如改变线粒体功能和细胞信号传导途径，都将引起凋亡细胞死亡。在前列腺癌细胞中，小白菊内酯可通过活化NADPH氧化酶产生ROS［29］。线粒体呼吸链是细胞内ROS产生的位置，并经常受到氧化应激的影响［21］。小白菊内酯可以通过调节氧化还原平衡状态，耗竭细胞内的GSH和蛋白巯基，从而使细胞死亡，达到抗肿瘤作用。此外，小白菊内酯能明显增加细胞内的ROS产生和胞浆中的钙水平。线粒体呼吸链是胞内ROS产生的主要位点，线粒体的完整性或功能受到破坏都会引起氧化应激。小白菊内酯通过活化caspases级联系统，降低线粒体膜电势，释放线粒体前凋亡蛋白，如人细胞色素C，半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活剂/家族直接结合蛋白等［28］，从而影响线粒体功能，引起氧化应激。截短型BH3结构域相互作用促凋亡蛋白 (tBid)的前凋亡活性和其它B淋巴细胞瘤－2基因 (Bcl－2)家族成员密切相关，所有Bcl－2家族可引起线粒体功能障碍，诱导凋亡。小白菊内酯通过caspase8途径使BH3结构域相互作用促凋亡蛋白 (Bid)逐步裂解成tBid蛋白，诱导线粒体细胞死亡［15］。

4 维持JNK活性

JNK、蛋白激酶 (ERKs)、P38构成丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)［30］。在活化环中所有的MAPKs被苏氨酸和酪氨酸双磷酸化激活，并进入核内磷酸化靶向转录因子，如c－Jun［15］。JNK 是 DNA 结合的 NF－κB 的独立的抑制剂并可以产生 ROS［31］，最终使细胞凋亡。然而 Kennedy等发现JNK在细胞中有着不同的作用:JNK一过性活化具有抗凋亡作用;JNK持续活化具有凋亡前作用。并且JNK的持续活化部分被NF－κB控制。小白菊内酯能活化JNK和抑制NF－κB。并且小白菊内酯通过JNK途径对细胞增殖的抑制与细胞类型有关。甚至Saadane等认为小白菊内酯的主要作用是活化JNK，且活化JNK所需的小白菊内酯浓度与细胞中NF－κB水平有关［32］。此外 Nakshatri等通过实验证实小白菊内酯通过JNK途径诱导的细胞死亡依赖于细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL)的敏感性［30］。综上，小白菊内酯通过多种途径活化JNK。

5 调节DNA甲基化作用

5＇－半胱氨酸－鸟氨酸 (5＇－CpG)岛的超甲基化使肿瘤抑制基因沉默。DNA甲基化抑制剂可调节DNA甲基化，促进癌细胞分化和凋亡，这已成为化疗的一个新策略［33］。启动区的5＇－CpG序列的半胱氨酸DNA甲基化作用是控制基因转录、基因组稳定和遗传铭记的表观遗传学机制［31］。DNA甲基转移酶 (DNMTs)调节此过程的DNA甲基化作用。S－腺苷－甲硫氨酸 (SAM)作为甲基供体在C－5位置为半胱氨酸残基提供甲基形成5－甲基半胱氨酸［31］。DNA甲基化之前，半胱氨酸从DNA双螺旋“溢出”形成过度状态，它和具有催化作用的Cys1226的巯基一起使ß去除后在DNMT1催化位点引起4，5烯胺的活化，ß去除可以释放DNMT1和5－甲基半胱氨酸。小白菊内酯对细胞的低甲基化作用主要有:小白菊内酯的γ－亚甲基内酯环通过烷基化反应中的Cys1226巯基的催化结构域硫醇盐抑制DNMT1;使G1期细胞静息或干扰转录因子Sp1与DNMT1启动区结合，下调DNMT1表达［33］。异常表观遗传学的病人对于目前的DNA甲基化抑制剂无反应，小白菊内酯的研究给予希望，这对于其他以DNMT活性为特点的实体瘤和非增殖性癌症的治疗可能有了新的突破口。

6 促进鼠双微体2(MDM 2)的泛素化

MDM2属于一类含有泛素 (ubiquitin)酶配体环指域的蛋白质，泛素配体可以介导蛋白酶体对蛋白质的降解作用及对蛋白酶体本身的降解作用。MDM2最重要的底物是P53，P53作为一种肿瘤抑制蛋白，是许多信号途径的关键节点［34］。P53的失活可引起MDM2在一些肿瘤细胞中过度表达，MDM2的过度表达与癌症的转移和复发有关，它是远处转移的重要风险因子，并和病人的预后差有关，MDM2的过度表达还可负向调节E黏附蛋白，使癌症进展和转移。P53能控制细胞周期的进展和凋亡。MDM2和P53属于一种反馈调节环的一部分，在许多肿瘤细胞中，该环受到破坏，因而这种反馈调节成为研究抗癌药物的靶向目标［34］。P53主要受MDM2肿瘤蛋白的负反馈机制调节，升高P53可以降低MDM2的表达，MDM2使P53隔绝和泛素化，进而被蛋白酶体降解，最终从细胞核去除。虽然MDM2对P53水平严密监控，但丝氨酸/苏氨酸激酶和毛细血管扩张性共济失调突变基因 (ATM)使P53的－NH3端磷酸化，降低MDM2对P53的作用，因而增加了P53稳定性。但P53的—COOH端的乙酰化转移酶P300/CB Phe P/CAF对P53的乙酰化作用促进P53的转录活性［34］。MDM2使赖氨酸去乙酰化酶HDAC1结合到P53－MDM2复合物上，使P53去乙酰化并促进MDM2介导的泛素化作用［34］。小白菊内酯通过重组人组蛋白去乙酰化酶－1(HDAC1)泛素化和蛋白酶体降解机制消耗细胞内HDAC1蛋白，HDAC1蛋白的丢失增加组织蛋白H3的乙酰化作用并活化肿瘤抑制蛋白P21［35］。有趣的是，虽然P53是P21的一种转录活化因子，P21增加需要ATM却不需要P53。小白菊内酯处理的细胞以ATM依赖的方式诱导MDM2泛素化和对蛋白酶的降解，与HDAC1非常相似，并导致P53活化及下游凋亡和细胞周期控制蛋白的活化。小白菊内酯可引出和维持ATM活性，甚至在ATM很少的情况下［34］。

小白菊内酯主要抗肿瘤作用机制为抑制 NF－κB和STAT3的信号通路、氧化应激作用、调节线粒体活性、维持JNK活性、调节DNA甲基化、和促进MDM2的泛素化。小白菊内酯在不同肿瘤中通过多种作用机制发挥抗癌作用，并且这些机制相互影响，相互制约。尽管小白菊内酯在体外实验表现出许多抗肿瘤效应，但其在体内由于低溶解性而表现出弱的活性。最近合成的小白菊内酯二甲氨基类似物DMAPT，可以改善小白菊内酯的溶解性和生物利用度［21］，并已在体外成功用来根治急性髓细胞白血病干细胞［36］，以及前列腺癌［2］，肺癌和膀胱癌细胞［12］等。此外，小白菊内酯对正常细胞具有较低的毒副作用。这些结果都表明小白菊内酯有望成为一种崭新的抗肿瘤药物。小白菊内酯药理作用的研究仍不是十分透彻，需进一步研究。

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