竹节参总皂苷对慢性脑缺血大鼠海马GFAP、GAP－43表达的影响

王 敏 张秋霞 邹海艳 赵 晖 李 佳

(首都医科大学中医药学院，北京，100069)

竹节参是五加科植物竹节参(Panax Japonicus C.A Meyer)根茎，为国家珍稀名贵药材。本实验室前期研究发现竹节参的主要活性部位－竹节参总皂苷(Total Saponins of Panax japonicus，TSPJ)可以改善慢性脑缺血大鼠学习记忆能力［1］。为进一步探讨药物作用的机制，本研究拟观察竹节参总皂苷对慢性脑缺血大鼠海马脑区星形胶质细胞增生和生长相关蛋白GAP－43表达的影响。

1 材料

1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠，体质重280～300g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供［合格证号SCXK(京)2006－0009］。饲养在首都医科大学实验动物中心［许可证号SYXK(京)2005－0022］。12h光照/黑暗周期，环境温度(22±1)℃。动物自由进食进水，适应3天后正式进行实验。

1.2 药物 竹节参药材，购于湖北，由首都医科大学李佳副教授鉴定为五加科人参属植物竹节参(Panax japonicus C.A.Mey.)的干燥根茎。TSPJ得率9.58%，由首都医科大学中医药学院中药化学实验室提供，为淡黄色粉末(批号:20080707)，临用前以生理盐水稀释至所需浓度。

1.3 试剂 兔抗鼠GFAP单克隆抗体、兔抗鼠GAP－43单克隆抗体羊抗兔IgG均购自Epitomics公司;抗β－Actin兔多克隆抗体、Tis－组织蛋白抽提试剂、BCA蛋白定量试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.4 仪器 BIO－RAP MODEL 680型酶标仪，北京元业伯乐科技发展有限公司;垂直电泳槽，美国BIORAD公司;稳压稳流电泳仪/电转仪，美国BIO－RAD公司生产。

2 实验方法

2.1 动物分组 60只SD雄性大鼠体重(280～300g)，用随机数字表方法将实验动物随机分为4组，即假手术组、模型组、TSPJ组(200、100mg·kg－1)，每组10只动物。

2.2 模型制备 参考文献方法［2］，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，大鼠仰卧固定，颈前部正中切口，分离双侧颈总动脉，进行永久性结扎，缝合伤口。假手术组大鼠仅游离双侧颈总动脉后缝合伤口，各组大鼠同条件饲养。

2.3 给药 造模24h开始给药，每日1次，连续给药30天后进行各项指标检测。假手术组及模型组动物灌胃给等容量生理盐水。

2.4 海马GFAP GAP－43蛋白检测 动物，断头处死，迅速在冰盒中分离海马组织，放置液氮;Tis－蛋白抽提试剂抽提海马组织蛋白，BCA法蛋白定量;10%的SDS－PAGE凝胶电泳，上样量为10μg，电泳结束后，进行蛋白质转膜;与GAP－43一抗(1:100 00)、GFAP一抗(1:200 00)杂交反应;再将NC膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1:100 00)杂交反应1h，在暗室进行X－光胶片曝光、显影和定影。然后用同一张NC膜与内参GAPDH(1:100 00)进行杂交反应。采用YLN－2000凝胶影像分析系统分析目的条带，目的蛋白吸光度值和内参蛋白吸光度值的比值，作为目的蛋白表达的相对水平。

2.5 统计方法 运用SPSS 10.0进行方差分析，LSD检验比较两组间差异。结果以(s)表示。

3 结果

Western blot结果显示，慢性脑缺血30天大鼠海马GFAP表达明显上调(P＜0.01);TRPJS能明显上调海马GAP－43蛋白的表达，下调海马GFAP蛋白的表达，与模型组差异显著(P＜0.01)。

表1 各组大鼠海马GAP－43、GFAP蛋白的相对表达量(s，n=5)

表1 各组大鼠海马GAP－43、GFAP蛋白的相对表达量(s，n=5)

注:与模型组相比，＊＊P ＜0.01。

GAP－43/GAPDH GFAP/GAPDH假手术组 － 0.85±0.10 0.93±0.10分组 剂量/mg·kg－1＊＊模型组 － 0.74±0.16 1.83±0.11 TSPJ 100 1.02±0.14＊＊ 1.22±0.21＊＊TSPJ 200 1.13±0.16＊＊ 0.96±0.32＊＊

图1 Western blot检测大鼠海马GAP－43、GFAP蛋白的表达

4 讨论

突触可塑性是学习记忆的重要神经基础，海马直接参与信息贮存和回忆，是脑内参与记忆贮存功能的重要部分，慢性脑缺血可损害海马突触可塑性引起学习记忆能力下降［3］。GAP－43对新突触形成及功能完善具有显著的调控作用［4］。成年大部分脑区GAP－43表达水平较低，新皮质、嗅球和海马GAP－43mRNA一直保持在较高水平。损伤时，这些区域的神经元都表现为侧枝出芽和反应性轴突再生，并伴随着GAP－43表达增高，这是机体自我修复的一种正常反应［5］。本次实验中，我们观察到慢性脑缺血30天后，海马GAP－43的表达较假手术组有降低趋势，结果提示，机体内源性修复能力有限，GAP－43的表达会随着缺血时间的延长而逐步降低。星形胶质细胞在节突触可塑性及突触功能活动中发挥着关键性作用［6］。GFAP作为星形胶质细胞的特异性标志蛋白，是星形胶质细胞活化及增殖的标志物之一，脑缺血后海马出现的过度增殖的胶质细胞以及胶质疤痕的形成不仅影响到正常的局部神经回路，而且可能是继发癫痫以及认知功能损害的重要因素［7］。因此调节GAP－43表达，有效抑制星形胶质细胞的过度增殖，防止胶质疤痕的形成是脑保护的研究重点。

竹节参是五加科植物竹节参Panax Japonicus C.A Meyer根茎，为国家珍稀名贵药材。早在清代《纲目拾遗》中有载，称其为“血症良药”。竹节参与人参和三七是同科同属的植物，目前的研究认为，皂苷是人参属植物的主要有效成分。竹节参的化学研究证实竹节参中的皂苷既有齐墩果烷型五环三萜皂苷，也有在人参和三七中活性最显著的达玛烷型四环三萜皂苷以及甾体皂苷。本实验室前期研究工作发现——竹节参的有效活性部位，总皂苷对多种脑缺血模型有很好的保护作用，能够改善脑缺血动物的神经功能症状和血液流变学指标，减轻脑组织病理形态学改变，同时能够提高拟血管痴呆模型动物的学习记忆能力［8－10］，本次研究发现竹节参总皂苷可上调慢性脑缺血大鼠海马神经生长相关蛋白GAP－43的表达，降低海马星形胶质细胞的增生有一定的相关性。

［1］赵晖，王蕾，张秋霞，等.竹节参总皂苷对血管痴呆大鼠递质氨基酸及自由基代谢的影响［J］.中国老年学杂志，2010，11(30):3096－3098.

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