人骨髓间充质干细胞体外成骨与成脂分化过程中FGF1及其受体表达的变化

董 平，焦 虎，李秋晨，吕晓岩，尹艳花，肖 苒

(中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院研究中心，北京100144)

人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs)因具有自我更新和多向分化能力而被广泛应用于组织工程与再生医学，对hBMSCs多向分化能力的调控是其临床应用的基础。成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)及其受体(fibroblast growth factor receptor，FGFR)是调控成骨与成脂发生的重要分子［1-2］，然而它们在hBMSCs成骨与成脂分化过程中的动态表达及其作用机制并不清楚。本实验就hBMSCs在成骨与成脂分化过程中FGF1及其受体mRNA的动态表达进行系统研究，并进一步探讨外源性FGF1对于hBMSCs成骨与成脂分化的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂

DMEM和青霉素-链霉素(HyClone公司);PBS(Sigma公司);胎牛血清和0.25%胰蛋白酶(Gibco公司);M-MLV反转录酶(Invitrogen公司);dNTP和oligodT(Promige公司);引物合成(北京赛百盛);SYBER Green Master Mix(Roche公司);小鼠抗人FGF1抗体(sc-101145)、(Santa Cruz公司);Alexa Fluor® 594驴抗小鼠IgG(A21203)(Invitrogen公司);重组人FGF1(北京义翘神州)。

1.2 hBMSCs的分离纯化和扩增

取健康志愿者(年轻男性，知情同意)髂骨骨髓血，密度梯度离心，取中间云雾层细胞接种培养并记为P0代细胞。接种后7～10 d，用胰蛋白酶消化传代纯化并扩增。

1.3 hBMSCs的定向诱导和鉴定

将P3代hBMSCs接种至6孔板，待细胞90%～95%汇合更换诱导分化培养基，此时记为第0天。成骨诱导(Os:低糖完全培养基+0.01 μmol/L地塞米松 +10 mmol/L β-甘油磷酸钠 +50 μmol/L抗坏血酸)21 d后细胞进行茜素红染色、成脂诱导(AM:低糖完全培养基+0.5 mmol/L异丁基甲基黄嘌+1 μmol/L地塞米松 +200 μmol/L吲哚美辛 +10 μmol/L胰岛素)10 d细胞进行油红O染色并在不同时间点real-time PCR检测相关标志基因。分别加入终浓度为 10和25 μg/L外源性 FGF1和20 000 U/L肝素的成脂诱导液诱导7 d后油红O染色并real-time PCR检测成脂标志基因表达。含相同浓度FGF1和肝素的成骨诱导液诱导3 d后检测成骨标志基因表达。

hBMSCs成骨分化鉴定:37℃用0.1%茜素红-Tris-HCl染液染色30 min，蒸馏水冲洗后镜下观察。

hBMSCs成脂分化鉴定:室温用油红O染液染色30 min，蒸馏水冲洗5 min，镜下观察。

1.4 Real-time PCR

根据Trizol试剂说明书提取细胞总 RNA，取500 ng总RNA进行反转录反应，然后real-time PCR检测相关基因表达水平。引物序列为:FGF1上游5'-TACAAGAAGCCCAAACTCCTC-3'，下游 5'-ATTTGGT GTCTGTGAGCCGT-3';FGFR1上游5'-ACCACCGACA AAGAGATGGA-3'，下游 5'-GCAGAGTGATGGGAGA GTCC-3';FGFR2IIIb上游5'-TCTGCCTGGCTCACTGTC-3'，下 游 5'-CTTGGTCGTGTTCTTCATTCG-3';FGFR2IIIc上游5'-GCTTGGCGGGTAATTCTATTG-3'，下 游 5'-CTTGGTCGTGTTCTTCATTCG-3';FGFR3IIIb上游 5'-AGGATGAACAGGAAGAAGCC-3'，下 游 5'-TCTG TCGAGCCACCAATTTC-3';FGFR3IIIc上游5'-CACC CTACGTTACCGTGCTCAA-3'，下游 5'-AGCCACGCA GAGTGATGAGAA-3';FGFR4上游5'-TGACTCCTTAC CTCCAGCA-3'，下 游 5'-ATGCCTCCAATGCGGTTCTC-3';RUNX2上游 5'-ACTGGCGCTGCAACAAGAC-3'，下 游 5'-CCCGCCATGACAGTAACCA-3';PPARγ上游5'-TGGAATTAGATGACAGCGACTTGG-3'，下 游 5'-CTGG AGCAGCTTGGCAAACA-3';GAPDH上游 5'-GCACC GTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游5'-TGGTGAAGACGCC AGTGGA-3'。

1.5 免疫荧光染色

分别取hBMSCs诱导前和诱导3 d的细胞爬片，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%Triton X-100透化5 min，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1.5 h，DAPI染细胞核，荧光显微镜下观察并采集图像。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 hBMSCs成骨、成脂诱导分化及鉴定

hBMSCs成骨诱导21 d发现明显的矿物质沉积，茜素红染色可见红色的矿化结节，成骨标志基因RUNX2表达升高(P＜0.01)，第7天到达峰值(图1A，B，C);hBMSCs成脂诱导10 d镜下细胞中可见明显脂滴，经油红O染色脂滴呈红色，成脂标志基因PPARγ表达显著增强(P＜0.01)(图1D，E，F)。

2.2 hBMSCs成骨、成脂分化过程中FGF1的动态表达

FGF1 mRNA在hBMSCs成骨诱导后1～3 d表达升高(P＜0.05)，之后逐渐恢复到诱导前水平;而FGF1在hBMSCs成脂诱导后1～5 d表达显著下降(P＜0.01)(图2A)。免疫荧光染色显示FGF1在hBMSCs中的表达有明显核质差异，主要在细胞质表达，成骨诱导3 d后核质差异减小，成脂诱导中FGF1蛋白表达明显减少(图2B，C，D)。

2.3 hBMSCs成骨、成脂分化过程中FGFRs的动态表达

FGFR1、FGFR2IIIb、FGFR2IIIc和 FGFR4 mRNA在hBMSCs成骨、成脂分化中呈现相同的表达趋势，并且在表达最高点与诱导前相比显著增强(P＜0.01)(图3A，B，C，F)。FGFR1 在成骨诱导中达到峰值的时间较成脂诱导晚(图3A);FGFR2IIIc和FGFR4在成脂诱导过程中表达始终高于诱导前(P＜0.05)，但在成骨诱导14 d表达显著低于诱导前(P ＜0.01)(图 3B，C，F);FGFR3IIIb和 FGFR3IIIc从诱导1 d起表达较诱导前显著降低(P＜0.01)，并且成脂诱导时下降较成骨诱导迅速(图3D，E)。

图1 hBMSCs成骨与成脂诱导分化及鉴定Fig 1 The osteogenic and adipogenic differentiation of hBMSCs

2.4 外源性FGF1对hBMSCs成脂分化的影响

在成脂分化诱导液中加入外源性的FGF1及肝素诱导hBMSCs 7 d后油红O染色发现4组都有脂滴出现，而加入FGF1的两组脂滴明显少于不加或只加肝素的两组，不同浓度FGF1两组之间并无明显差异(图4A，B，C，D)。相对于对照组，加入FGF1组能够显著抑制 PPARγ、C/EBPα的表达(P＜0.01)，肝素也有一定的抑制作用(图4E，F)。

2.5 外源性FGF1对hBMSCs成骨分化的影响

在成骨诱导液中加入同样浓度的FGF1以及肝素，诱导hBMSCs 3 d发现加入FGF1的两组成骨标志基因OPN表达显著升高(P＜0.01)，但FGF1并没有影响RUNX2的表达 (图5A，B)。

3 讨论

FGFs是一类多肽类活性物质，能够调控间充质干细胞的分化。大多数FGFs含有信号序列并以自分泌/旁分泌的作用结合并激活相应受体，发挥其生物功能。如在BMSCs诱导过程中发现自分泌的FGF18可以通过FGFR1与FGFR2介导地塞米松诱导的成骨分化，而FGF10能够通过旁分泌的方式激活FGFR2 IIIb从而促进成脂分化［2-3］。

本实验检测了FGF1在hBMSCs成骨与成脂分化过程中的动态表达，发现FGF1在两系分化早期呈现相反的变化，推测FGF1可能通过自分泌方式促进hBMSCs成骨分化而抑制其成脂分化。FGF1主要在hBMSCs细胞质中表达，成骨诱导3 d后核质中蛋白表达量差异减小，可能在成骨分化过程中FGF1蛋白发生了核转位。本实验发现FGFR1和FGFR2IIIc的表达趋势与FGF1同步或滞后，从表达量以及表达时间两方面综合分析，FGF1对hBMSCs成骨分化的作用可能主要由FGFR1和FGFR2IIIc来介导。

目前对于FGF1在干细胞成脂分化中的作用并不明确，根据对脂肪前体细胞的研究，FGF1能够通过抑制FGF2的表达促进其向脂肪细胞方向分化［4-5］，然而低浓度(6 ng/mL)的FGF1能够显著抑制骨髓间充质干细胞成脂分化，而且高脂饮食喂养敲除Fgf1的小鼠中也出现脂肪异常增生［6-7］。本实验中也发现FGF1能够抑制hBMSCs成脂分化，且与肝素有协同抑制作用。

有研究称FGF1能够促进MC3T3-E1细胞分泌骨钙素与骨桥蛋白，服用FGF1的正常动物在骨干处膜内成骨现象明显，并且在骨缺损部位，除了募集有成骨前体基质细胞外，还发现大量的FGF1，因此FGF1可能促进这些前体细胞成骨分化，但这种促进作用可能只发生在分化前期［8-9］。本研究中FGF1在成骨分化早期(3 d)表达升高，并且加入外源性FGF1成骨诱导3 d也发现骨桥蛋白表达增加，说明FGF1可能对骨髓间充质干细胞早期成骨分化有一定的促进作用。

骨髓中成骨细胞与脂肪细胞数量维持在一个平衡状态，并且二者均来源于一个前体细胞即BMSCs，有人认为PPARγ或Wnt可能参与调节这种平衡［10-11］。本研究发现FGF1在抑制成脂发生的同时促进成骨标志基因的表达，因而FGF1是否参与维持骨髓中成骨细胞与脂肪细胞的平衡还有待进一步研究。

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