微骨折术联合关节内注射tPRP修复兔膝关节软骨缺损的观察

张洪亮，姜鑫，张健

(1.潍坊医学院外科学教研室;2.潍坊市人民医院骨关节外科，山东潍坊261042)

关节软骨属于透明软骨，无血管、神经及淋巴系统，仅靠关节液供给大部分营养，因此损伤或缺损后自我修复能力十分有限，一旦出现上述情况，继发的创伤性关节炎、关节软骨退变及最终关节僵直将导致严重的功能障碍，生活质量下降。以往的实验研究证实微骨折术及tPRP对软骨修复有一定的效果，但并不是很理想。因此本实验通过对两种方法的联合应用，进一步探索软骨修复新途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂2月龄新西兰大白兔 (潍坊医学院动物实验中心提供)24只，雌雄不限。主要试剂 凝血酶(美Sigma公司)，肝素钠，3%戊巴比妥钠。

1.2 方法

1.2.1 tPRP的制备富血小板血浆由实验大白兔自体制备。自大白兔耳缘静脉获得的静脉血，经离心、分离、浓缩获得富血小板血浆，每1mL富血小板血浆加入1U凝血酶 (Sigma公司)活化;1500r/min离心15min后取上清，即为tPRP。加入肝素钠500U/mL，避免形成凝胶状。分装冻存于－80℃冰箱贮存备用。

1.2.2 动物模型制作、分组方法选用24只新西兰大白兔，随机分成4组，雌雄不限，3%戊巴比妥钠 (25mg/kg)耳缘静脉麻醉，双膝脱毛后碘伏消毒，暴露膝关节，用手摇钻于双后肢膝关节股骨髁间非负重区中央钻孔，直径5mm，深约1mm，达软骨全层，同时滴注生理盐水，防止局部过热导致周围软骨组织坏死。第1组，在软骨缺损区用软骨挫进行凿孔，小孔直径3～4mm，深度3～4cm，以可见脂肪滴或渗血为度，冲洗关节腔清除关节腔内碎屑。第2组，给予关节腔内注射tPRP0.4mL。第3组，应用微骨折技术制备微骨折模型后，充分清洗关节腔，给予注射tPRP0.4mL。第4组，空白不给予任何措施修复，以便组间比较。术前24h、术中及术后48h分别肌肉注射青霉素4万U/kg预防感染。4组分别于12w处死取材，行HE、甲苯胺蓝、Masson染色。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 大体观察主要观察每组动物模型软骨缺损区修复情况，每组修复区域修复软骨组织的厚度与正常组织边界区是否存在阶梯状况，是否存在裂隙，修复软骨组织表面的光滑度柔韧性。

1.3.2 组织学检查取12w处死动物取股骨髁间非负重区及周围1mm组织，并进行HE染色，观察不同组别软骨缺损中央处修复后软骨组织形态，包括新生软骨细胞形态及数量、新生软骨细胞周围基质情况、新生软骨厚度，观察不同组别修复缺损区与正常组织过渡区的修复情况。根据修复组织的性状、组织结构特征、周围软骨有无退变等特征，参照O'Driscoll，KeeleyandSalter组织形态学评分标准对各组动物修复效果X进行定量评分。

1.3.3 免疫组化观察不同组别修复区域中心部分Ⅱ型胶原表达的量 (及染色的深浅程度)，修复区域中心部分软骨细胞分布情况，修复区域与正常组织的过渡情况 (是否存在裂隙)。

1.4 统计学处理对各修复效果Xij参照O'Driscoll，KeeleyandSalter组织形态学评分标准进行定量评分，采用单因素方差分析及两两比较的方法进行统计学分析。

2 结 果

2.1 大体观察12w后，第1实验组观察可见软骨缺损区所形成软骨形态，已被较致密的白色有光泽的软骨组织所覆盖，修复组织表面不平滑，厚度接近或超出正常边界软骨，质韧，边界仍可见。第2实验组观察软骨缺损区覆盖完全，色白，较平滑，修复范围仍可见。第3实验组即结合组缺损区软骨修复组织与正常软骨很难辨别，厚度、色泽、硬度等与正常软骨组织接近。第4实验组软骨缺损区灰白色，色泽灰暗，未完全覆盖，仍残留正常组织边界。3个处理动物组都存在一定程度上的修复，在大体观察方面没有显著差异，但3个处理实验组与空白对照组存在显著差异。

2.2 组织学检查本次试验以活体动物体内处理12w作为终止时间，将兔膝关节股骨髁间非负重区软骨缺损休复处与周围1mm范围正常的软骨共同取材，分别进行HE染色、亚甲基蓝染色、Masson染色。三色染色后可以发现除第4实验组外，第1、2、3实验组新生的软骨组织与周围正常软骨组织结构类似，新生软骨细胞与周围正常软骨细胞形态基本相似，新生软骨细胞成簇状分布，数量较多且周围包绕丰富的软骨基质 (图1)。HE染色可发现第1实验组新生软骨细胞均匀分布在已修复组织区内，但与正常软骨组织交界存在一定裂隙;第2实验组与第1实验组比较可见新生软骨组织与正常结构类似，镜下观察交界区模糊，整合良好，未见明显呈簇状分布的软骨细胞和裂隙;第3实验组可见软骨组织修复区与正常组织区无明显区别，难分彼此，未见裂隙或交接过渡性组织学变化 (图2)。亚甲蓝染色观察见第1、2、3实验组新生软骨细胞周围都出现大量软骨细胞基质，较正常组织染色稍淡。Masson三色法染色可见第1、2、3实验组新生软骨细胞内及周围呈现亮蓝色，表明软骨基质的合成与分泌功能旺盛;第4实验组染色可见新生组织基本为纤维结缔组织，未见明显的软骨组织增生。

2.3 免疫组化软骨细胞的分化表型维持的特异性指标是Ⅱ型胶原的合成与分泌，若缺乏Ⅱ型胶原的合成与分泌，软骨细胞很快会凋亡。依据Ⅱ型胶原的这一特性，检测12 w实验动物标本的Ⅱ型胶原，阳性对照为棕黄色。第1动物组 (图3)、第2动物组 (图4)、第3动物组 (图5)陷窝周围与新生软骨细胞染色尤其明显，分布呈条索状，与周围组织分界明显。

2.4 统计学结果参照O'Driscoll，KeeleyandSalter组织形态学评分标准统计出各组实验动物软骨缺损修复效果 (Xij)的评分，动物实验组组与对照组共4组数据，统计每组中每只兔膝关节软骨缺损效果评分Xij，然后进行组间比较。根据单向方差分析的思想，对数据进行统计学分析。表1是各组所得实验数据初步汇总;表2是各组统计结果计算F=30.17，P＜0.05，由此得出3种方式对软骨缺损的修复效果是不完全相同的。由表2可得出第3动物组修复效果明显优于其他实验组及对照组;第1实验动物组与第2实验动物组比较无统计学意义，得出两种方法修复软骨组织的效果尚无明显区别;同时第1、2实验组与第4对照组比较有统计学意义，得出两种处理方法对软骨修复有一定效果。

表1 各实验组软骨修复效果评分统计结果比较

表2 各实验组之间进行统计分析表

3 讨 论

创伤、退变等原因导致的关节软骨缺损是临床常见的多发性疾病。由于关节软骨具有自身无血供，多能分化前体细胞稀少等特点，软骨几乎无自我修复能力，其自发的修复过程是形成生物力学性能较差的纤维软骨或纤维瘢痕组织。以往的微骨折术、自体软骨移植及组织工程等在软骨修复方面虽取得一定效果，但仍存在未能理想的解决软骨力学性能、强度退化明显及持久耐用的透明软骨生成困难等问题［1］。

3.1 修复与整合的关系［2］诸多关节软骨修复方法，可以从不同程度上减轻患者的症状，近年来随着软骨修复技术的进展，软骨修复与整合的关系逐步受到重视。软骨整合良好能明显改善关节功能，延长修复组织的寿命，整合不良则可导致关节面受力不均而加速软骨退变。软骨修复仰赖于软骨再生，而软骨再生是指由新生软骨替代损伤或缺损软骨组织的过程，而此过程再通过局部微环境的应力性刺激与组织塑形性逐步恢复软骨组织中各组成部分的形态与功能。影响软骨修复质量的关键因素为:新生组织与周围组织的表面整合，新生组织能否承受机体的正常力学环境。关节软骨的良好整合需要两个条件:一是新生软骨与软骨下骨的整合;二是新生软骨组织与周围软骨组织的整合。整合不良往往导致活动的关节面受力分布不均衡从而加速软骨的退变，因此良好的整合既能明显改善关节功能，又能延长修复软骨组织的使用寿命，从而提高患者的生活质量［3］。本实验发现微骨折联合tPRP修复缺损软骨与周围正常软骨组织整合效果良好，交界区未见明显裂隙，移行性好，退变轻微，修复软骨厚度基本满意。

3.2 微骨折术在软骨修复中的作用关节软骨损伤或缺损后微骨折技术修复是临床骨科及实验研究的热门话题之一［4］。Steadman等对233例患者采用微骨折治疗，3年随访结果显示75%患者疼痛改善，11年的临床随访显示客观功能指数显著提高，7年的主观评价有80%患者表示微骨折术后症状缓解［5］。然而术后组织学观察其生物力学强度较正常软骨组织差，不能满足长时间关节软骨的需要［6］。

3.3 tPRP在软骨修复中的作用关节内注射tPRP、tPRP与支架材料或软骨细胞体外复核后植入软骨缺损处，能够有效的修复关节软骨缺损和延缓骨关节炎的发生［7］。细胞因子在软骨修复整合中的作用至关重要。富血小板血浆含有血小板源性生长因子 (PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子 (TGF－β)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子 (IGF)成纤维细胞因子等多种生长因子，PDGF、TGF、IGF及VEGF等已证实能够促进软骨细胞代谢、基质合成，是促进修复软骨整合的细胞因子［8］。

3.4 联合应用的意义与展望 实验研究证实单纯tPRP修复软骨缺损2月后关节MRI结果显新生软骨组织未能与正常软骨组织在形态上达到完全一致，而tPRP联合软骨细胞在软骨缺损处可形成明显的软骨样组织［9］。临床所接触的关节软骨损伤或退变的患者中，软骨缺损多为较大范围的剥脱，缺损区较大直径一般大于4 cm，且缺损周缘边界不规则，单一运用微骨折术修复区域与边界区域整合效果一般。因此应用两种方式实现优劣势的互补，进一步实现修复与整合的统一，给软骨修复的研究提供新的研究方向及思路。

(此文图1－5见附页4－5)

图1 HE染色微骨折组、tPRP组、联合应用组可见新生软骨均能对软骨缺损区进行修复，修复后显示新生软骨呈簇状散布于软骨陷窝内 (×400)

图2 HE染色显示联合应用两种处理方法的实验组修复后的软骨组织与周围正常组织间移行良好，实现了比较理想的整合 (×400)

图3 Masson染色注射tPRP修复组Ⅱ型胶原表达较丰富(×400)

图4 Masson染色单纯微骨折术修复组Ⅱ型胶原表达量较tPRP组及复合组少，染色淡 (×100)

图5 Masson染色联合组与tPRP组及微骨折组比较，显示Ⅱ型胶原表达的表达量明显多于单一处理方法 (×400)

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