117例急性冠脉综合征病人CYP2C19基因多态性及中医证型分布的研究1）

吕嘉荣，沈智杰，王英杰，陈铁军，王肖龙

冠心病目前已经成为危害人类健康和导致死亡的重要疾病之一，根据2005年统计，我国每年死于心血管病的人数约为300万，占死亡人数的45%左右。急性冠脉综合征（ACS）是冠心病的主要危险事件，ACS最重要的病理生理机制是动脉粥样硬化斑块破裂引起的血栓形成，致使血管狭窄或闭塞，冠状循环发生障碍，引发心肌缺血缺氧或坏死。冠脉支架术是治疗冠状动脉狭窄和冠状动脉闭塞最有效的方法之一，而支架内血栓形成和再狭窄是支架术后发生主要不良心脏事件的重要原因。氯吡格雷是目前冠脉支架术后预防再狭窄的一线药物，但由于氯吡格雷的个体差异性，部分病人对其表现为低应答甚至无应答，即“氯吡 格 雷抵 抗 （CR）”。CR 的 机 制很 多[1]，目 前认 为 与CYP2C19基因多态性密切相关。中医药对氯吡格雷抵抗有其独特的优势，临床研究[2，3]显示麝香保心丸对ACS氯吡格雷抵抗病人有效，可降低血小板聚集率等；通心络胶囊可以降低ACS病人血浆血小板活化指标，减少氯吡格雷抵抗的发生。本研究通过对ACS病人证型分布以及基因多态性研究以探讨氯吡格雷抵抗病人证型分布与基因型的关系，为中医药对氯吡格雷抵抗病人的干预研究提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2012年6月—2013年4月在上海中医药大学附属曙光医院心血管内科诊断为急性冠脉综合征（包括不稳定型心绞痛、ST段抬高性心肌梗死、非ST段抬高性心肌梗死）且服用氯吡格雷的病人117例，男88例，女29例，年龄63.74岁±9.91岁。

1.2 试剂和仪器 血液基因组柱式小量提取试剂盒（北京康为世纪，cw2087），快速DNA产物纯化试剂盒（北京康为世纪，cw2301），Blend taq plus PCR 酶（日本 Toyobo，BTQ－201），Sma I Fast digest限制性内切酶（美国Fermentas，FD0664），Eppendorf Centrifuge 5430R 离心机（德国eppendorf），Stepone plus PCR仪（美国life technologies），核酸电泳仪、电泳槽（上海天能科技有限公司）凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）。

1.3 CYP2C19＊2基因型分析

1.3.1 CYP2C19＊2DNA扩增 全血基因组DNA的提取：采用DNA提取试剂盒进行DNA抽提。PCR扩增：抽取研究对象静脉血2mL，EDTA（乙二胺四乙酸二钠）抗凝用于提取基因组DNA，共收集病例117例，血样117份，－80℃保存。CYP2C19基因引物根据Jean－Sebastien Hulot等文献[4]设计：上游引物序列为 5′－CAGAGCTTGGCATATTGTATC－3′，下游引物序列为5′－GTAAACACACAACTAGTCAATG－3′。PCR 体 系 （50 μL）：5μL PCR buffer，5μL dNTP，1μL上游引物，1μL下游引物，1.25Ublend taq Plus酶，1μL DNA模板，无菌超纯水35.751μL。PCR反应程序：94℃预变性5min→94℃变性30s→56℃退火20s→72℃延伸20s，共35个循环，最后72℃延伸5 min。

1.3.2 PCR的RFLP分析 将2μL酶切buffer，1μL SmaI限制性内切酶和17μL回收的PCR产物加入0.5mL离心管中，混匀后在37℃水浴中酶切2h。将酶切产物在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，用凝胶成像系统将电泳结果拍照。

1.4 中医冠心病证型判定标准 参照《中药新药治疗胸痹（冠心病心绞痛）的临床研究指导原则》[5]制定：分为心血瘀阻证、气虚血瘀证、气滞血瘀证、痰阻心脉证、阴寒凝滞证、气阴两虚证、心肾阴虚证、阳气虚衰证。

1.5 统计学处理 采用SPSS 20.0软件进行统计学处理，基因型频率和等位基因频率采用基因计数法计算，基因型与证型分布的关系行卡方检验。

2 结 果

2.1 PCR－RFLP分析结果 CYP2C19基因外显子5中第68 1个碱基由G突变为A，导致SmaI酶切位点消失。利用PCR－RFLP法对CYP2C19m1进行基因分型，野生型CYP2C19纯合子（wt／wt）酶切电泳后呈现两条带，分别是171bp、113bp；CYP2C19m1突变型纯合子（m1／m1）呈一条带为284bp；CYP2C19wt与CYP2C19m1杂合子（wt／m1）则同时具备上述3条带详见图1。

图1 CYP2C19基因分布情况

2.2 各基因型病人的分布情况 氯吡格雷慢代谢型（突变纯合子）的基因型频率为0.085，突变杂合子病人基因型频率为0.453，正常代谢组（正常纯合子）病人基因型频率为0.462；正常等位基因频率为0.688，突变等位基因频率为0.312。详见表1。

表1 氯吡格雷各基因型病人的分布情况

2.3 急性冠脉综合征病人中医证型分布情况 心血瘀阻证22例（18.8%），气虚血瘀证60例（51.3%）。气滞血瘀证11例（9.4%），痰阻心脉证7例（6.0%），阴寒凝滞证3例（2.6%），气阴两虚证6例（5.1%）、心肾阴虚证2例（1.7%），阳气虚衰证6例（5.1%）。各组间经卡方检验差异有统计学意义（P＝0.000），尤以气虚血瘀证型最为常见。

2.4 证型分布与基因多态性的关系（见表2） 各中医证型比较差异无统计学意义（P＝0.718＞0.05），表明证型分布与基因分型无显著相关。

表2 ACS病人证型与基因多态性分布情况例

3 讨 论

细胞色素P450酶系是是由一组结构和功能相关的超家族基因（superfamily gene）编码的同工酶，主要存在于人的肝微粒体中。其中CYP2C19是氯吡格雷主要的代谢酶。CYP2C19＊2、3突变位点对于氯吡格雷可以减弱其代谢，影响临床疗效。氯吡格雷慢代谢人群比例分布，各地均有报道[6]，4%～30%不等，国外多数文献报道的氯吡格雷抵抗的发生率波动于4.2%～31%，亚洲人群CYP2C19＊2变异型等位基因频率约为30%，白人约13%，非洲裔美国人约18%。Muller等[7]在105例PCI病例发现约5%的病人对氯吡格雷无反应，且术后发生了血栓形成。王明亮等[8]收集100例急性冠脉综合征病人，研究发现氯吡格雷抵抗的病人有23例，发生率为23%。蒋娟娟等[9]通过对24名健康受试者口服150mg氯吡格雷，探针法测定CYP2C9，CYP2C19基因型，并通过观察不同时间点病人血小板聚集率的变化发现CYP2C19基因突变者对氯吡格雷反应性降低，其中纯合子组和杂合子组的血小板聚集率较野生型均有不同程度降低，且突变纯合子组较野生型药效显著降低。谭洁等[10]对江苏191例PCI术后病人的研究表明，CYP2C19野生纯合型出现氯吡格雷抵抗的概率为11.0%、突变杂合型为29.8%，突变纯合型为48.0%，差异有统计学意义，提示氯吡格雷抵抗的发生与CY2C19基因型有一定相关性。并有研究[11]表明氯吡格雷的反应性与基因型具有量效关系，携带功能缺失等位基因越多，对氯吡格雷的反应性就越差。本研究结果显示，氯吡格雷慢代谢型（突变纯合子）的人群比例为8.5%，突变杂合子病人比例45.3%，正常代谢组（正常纯合子）病人比例为46.2%，正常等位基因频率为0.688，突变等位基因频率为0.312。

目前临床上将冠心病分心血瘀阻证、气虚血瘀证、气滞血瘀证等8种证型。而在临床上单纯的一型较少，常常夹有痰湿、痰浊。研究报道[12]急性冠脉综合征的中医证候有以下特点：实证多见血瘀证，虚证多见气虚证。其中血瘀证在实证里出现的比例达到90.5%，气虚为75.6%。王昀等[13]通过对202例急性冠脉综合征病人的调查发现，阳虚为急性冠脉综合征的主要病机，阳虚及各兼证组比例达30.8%。张娅等[14]将405例行PCI成功的冠心病病人是否有气虚血瘀证表型分为气虚血瘀组和非气虚血瘀组，发现气虚血瘀组CYP2C19＊2基因突变型明显高于非气虚血瘀组。陈慧等[15]对415例血瘀证型的冠心病病人随访发现，重度血瘀证与CYP2C19＊2突变不仅与冠心病病人血小板聚集率相关，而且增加PCI术后再发心血管事件的风险。本研究结果显示，117例病人中以血瘀证型病人居多，其中气虚血瘀型病人占51.28%，与相关文献报道数据吻合。但证型分布与基因多态性交叉检验未见明显差异，究其原因主要与样本量有关。后续拟进一步扩大研究样本，同时进行对于气虚血瘀型病人的中药干预研究以获得更多的理论依据。

研究CYP2C19基因多态性对于急性冠脉综合征早期氯吡格雷抵抗人群的筛查和及早预防具有一定的指导意义。对于临床氯吡格雷抵抗的病人，应及早的调整药物用量或改换其他抗血小板药物以预防支架内血栓的形成。同时，对于证型分析的研究提示，急性冠脉综合征病人中，血瘀证为主导证型，尤其以气虚血瘀型表现最为显著，故中西医结合治疗以益气活血药物辅助干预为宜。

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