Bmi-1和hTERT在胃癌组织中的表达及临床病理意义

刘晓丽 马礼鸿 王 凯 (遵义医学院附属医院病理科，贵州 遵义 563003)

肿瘤与原癌基因激活、抑癌基因失活所造成的肿瘤细胞恶性增殖、免疫逃逸密切相关。Bmi-1和hTERT是与细胞增殖密切相关的基因〔1〕。本研究旨在探讨Bmi-1和hTERT在老年胃癌组织中的表达情况及其与病理分期的相关关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2005年1月至2012年5月我院老年胃癌患者100例作为观察组，其中男67例，女33例，年龄43～61〔平均(52.38±6.38)〕岁;选择在我院就诊的胃良性肿瘤患者50例作为良性对照组，其中男34例，女16例，年龄39～60〔平均(52.39±6.32)〕岁;选择在我院进行体检的100名健康者作为健康对照组，其中男 65例、女 35例，年龄 40～60〔平均(50.98±6.29)〕岁。三组一般资料的差异不显著(P＞0.05)。

1.2 荧光定量PCR检测方法 取胃组织50 mg并用购买于Invitrogen公司的mRNA抽提及反转录试剂盒合成cDNA第一链。荧光定量PCR采用Takara公司的试剂盒，扩增体系:cDNA 2 μl、mastermix 10 μl、上下游引物各 0.4 μl、去离子水 7.2 μl;扩增条件:95℃、15 s，特异性退火温度72℃、30 s，40个循环。引物序列:β-actin:上游5'-TGTGTTGGCGTACAGGICTTTG-3'，下游5'-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3'，退火温度58.1℃。Bmi-1:上 游 5'-GCCCGCTGCTGTCTAATG-3'，下 游 5'-TTTACACGT CT CGGATCTTG-3'，退火温度 60.8℃;hTERT:上游:5'-AAGATGGTTACCTGCGACTG-3'， 下 游:5'-CCGGGTCTGGAACGATGACC-3'，退火温度62.1℃。分别扩增同一样本的目的基因和内参基因，通过ΔΔCt法求出观察组、良性对照组相对于健康对照组的mRNA含量。

1.3 免疫印迹检测方法 取胃组织50 mg加入蛋白裂解液300 μl后匀浆，离心后取上清 15.6 μl，加入上样缓冲液 4 μl、DTT 2.4 μl配成上样液。按配方配置10%的下层胶和5%的上层胶进行垂直电泳，100 V、20 min，120 V、90 min。垂直电泳结束后取出凝胶进行电转膜，封闭后加入羊来源的Bmi-1和hTERT第一抗体，4℃孵育过夜。TBST洗3遍，加HRP标记的驴抗羊二抗孵育1 h，而后进行显影。

1.4 统计学方法 采用SPSS18.0软件进行方差分析和单因素回归分析。

2 结果

2.1 各组胃组织中Bmi-1和hTERT的mRNA和蛋白含量观察组胃组织Bmi-1和hTERT的mRNA和蛋白含量均明显高于良性对照组和健康对照组(P＜0.05)。见表1。

2.2 胃癌患者不同TNM分期Bmi-1和hTERT的mRNA和蛋白含量 在不同TNM分期的观察组患者中，Bmi-1、hTERT的mRNA含量TNMⅠ＜TNMⅡ＜TNMⅢ＜TNMⅣ(P＜0.05)。见表2。

2.3 胃癌患者TNM分期与Bmi-1和hTERT含量的相关性胃癌患者的Bmi-1、hTERT的蛋白含量与TNM分期呈正相关(r=0.572、0.492，P ＜0.05)。见表3。

表1 各组Bmi-1、hTERT的mRNA和蛋白含量比较(±s)

表1 各组Bmi-1、hTERT的mRNA和蛋白含量比较(±s)

组别 n mRNA含量(ratio)Bmi-1 hTERT蛋白含量(ratio)Bmi-1 hTERT观察组 100 235.94±24.77 245.48±25.21 251.52±27.12267.41±29.42良性对照组 50 105.32±11.23 103.16±14.32 103.63±11.90 103.82±15.12健康对照组100 100 100 100 100 F/P值 9.758/＜0.05 10.382/＜0.05 9.758/＜0.05 10.382/＜0.05

表2 胃癌患者不同TNM分期Bmi-1、hTERT的mRNA和蛋白含量比较(±s)

表2 胃癌患者不同TNM分期Bmi-1、hTERT的mRNA和蛋白含量比较(±s)

TNM分期 n mRNA含量(ratio)Bmi-1 hTERT 蛋白含量(ratio)Bmi-1 hTERT TNMⅠ 23 123.56±11.42 135.26±13.98 115.56±12.22 129.43±13.23 TNMⅡ 28 165.13±14.53 175.96±18.21 145.13±15.41 169.55±17.52 TNMⅢ 30 245.94±25.88 268.55±29.52 235.94±26.13 262.95±28.32 TNMⅣ 19 358.25±39.6 396.05±40.17 328.52±34.6 346.42±35.23 F/P值 9.758/＜0.05 10.382/＜0.05 9.758/＜0.05 10.382/＜0.05

表3 胃癌患者病理分期与Bmi-1和hTERT含量的相关性

3 讨论

近年来，越来越多的临床试验和基础研究均极为关注胃癌发生的分子机制，旨在通过研究其分子机制来发现早期诊断胃癌的标志物〔3〕。目前认为，胃癌的发生与原癌基因激活、抑癌基因失活所造成的肿瘤细胞恶性增殖、免疫逃逸密切相关。其中，Bmi-1是一类原癌基因，在乳腺癌、直肠癌、肺癌等肿瘤中均有高表达〔3〕。相关研究显示，Bmi-1所编码的蛋白能够对p16、p19等抑癌基因发挥负性调节作用。在体内，p16、p19基因主要编码与细胞周期相关的蛋白，能够参与细胞增殖、分化、凋亡、衰老的调控〔4，5〕。hTERT是编码端粒酶逆转录酶的基因，仅在干细胞和肿瘤细胞中表达，参与端粒的复制〔6〕。当机体在环境因素、遗传因素等作用下发生Bmi-1、hTERT基因过度表达时，一方面会抑制p16、p19基因编码细胞周期蛋白，另一方面会造成端粒酶mRNA不断复制、不会随细胞增殖而缩短〔7〕。两者共同作用会造成细胞的增殖、DNA的复制不受抑制，发生恶性增殖，最终导致癌症的发生〔8〕。Bmi-1、hTERT基因的表达异常与胃癌的发生密切相关〔9〕。

本研究结果提示Bmi-1、hTERT基因的蛋白水平与肿瘤分期呈正相关，即肿瘤分期越高、Bmi-1和hTERT基因表达越多。

1 张爱荣，梁丽梅，许 颖，等.Bmi-1蛋白在胃癌组织中的表达及其与胃癌患者术后生存的相关性〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(18):3612-3.

2 Takubo K，Aida J，Sawabe M.The normal anatomy around the oesophagogastric junction:a histopathologic view and its correlation with endoscopy〔J〕.Best Pract Res Clin Gastroenterol，2008;22(4):569-83.

3 冯 艳，宋立兵，郭宝红.Bm i-1在乳腺癌组织中的表达及意义〔J〕.癌症，2007;26(2):154-7.

4 Glinsky GV，Berezovska O，Glinskii AB.Microarray analysis identifies a death from cancer signature predicting therapy failure in patients with multiple types of cancer〔J〕.J Clin Invest，2005;115(6):1503-21.

5 孙振华，卜 平.胃癌PRL-3与Bmi-1 mRNA联合表达的定量分析及其意义〔J〕.广东医学，2012;33(7):987-9.

6 李力铭，钱叶本.hTERT在原发性肝癌中的表达及其临床意义〔J〕.肝胆外科杂志，2010;20(3):218-1.

7 王 平，庞全海，夏 玉.基因与干细胞增殖和肿瘤发生研究进展〔J〕.动物医学进展，2012;33(6):122-5.

8 尹天泉，张 米，刘海莲，等.胃癌分化程度与神经分布相关性及癌细胞与神经细胞相互作用的研究〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(12):1505-9.

9 Silva J，Garcia JM，Pena C.Implication of polycomb members Bmi-1，Mel-18，and Hpc-2 in the regulation of p16INK4a，p14ARF，h-TERT，and C-Myc expression in primary breast carcinomas〔J〕.Clin Cancer Res，2006;12(23):6929-36.