人脐血和外周血单个核细胞中神经营养因子表达水平研究

范存刚，王栋梁，张庆俊，周景儒

(北京大学人民医院，北京 100044)

随着干细胞研究的深入，干细胞移植有望成为 治疗神经系统疾病的新方法。虽然已有胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓间充质干细胞修复神经损伤的报道［1，2］，但由于目前存在神经干细胞数量有限、取材困难，胚胎干细胞分离纯化技术困难、伦理与法律争议和形成畸胎瘤的风险，骨髓间充质干细胞随供者年龄增长出现含量和增殖能力下降的诸多问题［2，3］，因此，寻找可靠而易于获得的细胞来源，成为细胞移植治疗神经系统疾病的首要问题。人脐血细胞具有来源丰富、采集方便、无伦理和法律障碍等优点，能在适宜的条件下分化为神经细胞并修复神经损伤［4］，故有望成为治疗神经系统疾病的理想细胞来源。然而，体内移植后，仅有不足10%的人脐血单个核细胞(UCB-MNCs)表达神经表型［4］，难以解决动物模型或患者神经功能的迅速恢复问题。2009～2011年，我们检测了UCB-MNCs、成人外周血单个核细胞(APB-MNCs)内5 种神经营养因子的表达水平，旨在为阐明UCB-MNCs 修复神经损伤的机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 人脐血取自我院产科15例足月妊娠、正常分娩产妇的婴儿脐血，成人外周血取自我院健康查体的12例年龄22～38岁的成人外周血，均在无菌条件下采集。将脐血及外周血贮存于4 ℃冰箱内，在6 h 内进行细胞分离。1%牛血清白蛋白购自Sigma 公司;LG-DMEM、胎牛血清和青霉素、链霉素均为Gibico 公司产品;脑源性神经营养因子(BDNF)和神经营养因子-4/5(NT-4/5)的ELISA 试剂盒分别购自Chemicon 公司和Promega 公司;5 种神经营养因子的引物均由上海生工生物合成。

1.2 方法

1.2.1 UCB-MNCs、APB-MNCs 分离 先将每份血标本以含1%牛血清白蛋白的无菌PBS 液按1∶1 比例稀释，缓慢加入Ficoll-Paque，以800 g 离心25 min;然后于梯度界面收集MNCs，并以PBS 洗涤两次。先从每份分离的MNCs 中取出2 ×106个细胞，用于RNA 提取和PCR 检测。然后将剩余的MNCs以1 ×106个/cm2接种于含体积分数为10%的胎牛血清和1%青霉素、链霉素的LG-DMEM 中，于37℃、含5% CO2的孵箱中培养10 d;然后收集培养液上清进行酶联免疫吸附试验(ELISA)。

1.2.2 RNA 提取及引物合成 采用Trizol 提取液、按Trizol 使用说明书推荐的方法提取MNCs 中的总RNA，以260 nm 分光光度测定进行RNA 定量。逆转录体系的终体积为40 μL，其中含有2 μL 500 μg/mL的随机引物、2 μL 10 mmol/L的dNTP、2 μg 总RNA、16 μL 双蒸水。逆转录体系在65 ℃水浴中孵育5 min 后，加入8 μL 5 ×缓冲液、2 μL RNA 酶抑制剂、4 μL 0.1 mol/L的二硫苏糖醇，37 ℃孵育2 min 后加入2 μL 小鼠白血病病毒逆转录酶;37 ℃孵育1.5 h 后放入95 ℃水浴中10 min，再置于冰上5 min，以灭活转录酶。

5 种神经营养因子和内参(β-actin)的引物分别为:①胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)(400 bp):上游引物:5'-TTATGGGATGTCGTGGCTG-3'，下游引物:5'-TTTCATAGCCCAGACCCAAG-3'。②神经生长因子(NGF)(167 bp):上游引物:5'-ATACAGGCGGAACCA CAC-3'，下游引物:5'-GTAATGTTGCG GGTCTGC-3'。③神经营养因子-3(NT-3)(201 bp):上游引物:5'-TTGCCAGAAGACTCGCTC-3'，下游引物:5'-CAGTTCGGTGTCCATTGC-3'。④NT-5(246 bp):上游引物:5'-TAACGCTGAGGAAGGTGG-3'，下游引物:5'-AGGTCTCTCAGCATCCAG-3'。⑤BDNF(744 bp):上游引物:5'-ATGACCATC CTTTTCCTTAC-3'。下游引物:5'-CTATCTTCCCCTT TTAATGG-3'。⑥β-actin(578 bp):上游引物:5'-AT CTGGCACACCTTCTACA-3'，下游引物:5'-GTTTCGT GGATGATGCAACAGGACT-3'。

1.2.3 神经营养因子mRNA 表达检测 采用RTPCR 技术检测UCB-MNCs、APB-MNCs 中的GDNF、BDNF、NGF、NT-3、NT-4/5的mRNA 表达。电泳PCR 扩增体系的终体积为50 μL，各种成分的终浓度分别为dNTP 0.25 mmol/L、MgCl22.5 mmol/L、Taq DNA 聚合酶2.5 U/100 mL、KCl 50 mmol/L、Tris-HCl 缓冲液(pH 8.3)10 mmol/L。BDNF的循环条件为94 ℃、30 s，55 ℃、45 s，72 ℃、45 s;GDNF、NGF、NT-3 和NT-4/5的循环条件为94 ℃、30 s，52 ℃、30 s，72 ℃、30 s。PCR 产物在含有EB的2%琼脂糖凝胶中电泳，电泳结果在紫外线灯光下观察，并以数码照相系统采集图片。

1.2.4 BDNF、NT-4/5 分泌检测 采用ELISA 法检测UCB-MNCs 和APB-MNCs 培养液上清中的BDNF、NT-4/5 分泌水平，按照BDNF、NT4/5的ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.2.5 统计学方法 BNDF 和NT4/5的分泌水平以±s 表示，以t 检验进行比较。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UCB-MNCs、APB-MNCs 培养结果 显微镜下观察发现，UCB-MNCs、APB-MNCs 在培养24 h 时均有部分细胞悬浮，更换培养液后大部分细胞开始呈贴壁生长，并呈现圆形、卵圆形、纺锤形等细胞形态。培养第10 天时，上述细胞均达到80%～90%的汇合程度。

2.2 UCB-MNCs、APB-MNCs 中各神经营养因子的mRNA 表达 RT-PCR 检测显示，UCB-MNCs 中的GDNF、BDNF、NGF、NT-3、NT-4/5的mRNA 表达水平均高于APB-MNCs(见图1)。

图1 UCB-MNCs、APB-MNCs 中GDNF、NT-5、NGF、NT-3 和BDNF的mRNA 表达

2.3 UCB-MNCs、APB-MNCs 培养液上清中的BDNF、NT-4/5 分泌差异 ELISA 法检测显示，UCBMNCs、APB-MNCs 培养第10 天时，其培养液上清中的BDNF 分 泌 水 平 分 别 为(827.50± 48.68)、(155.65±56.03)pg/mL，NT4/5 分别为(236.64±7.51)、(60.53±10.81)pg/mL，即UCB-MNCs 培养液上清中的BDNF、NT4/5 分泌水平分别约为APBMNCs的5、4 倍(P 均＜0.01)。

3 讨论

近来研究表明，人脐血细胞能在体内外环境中被诱导分化为神经元和胶质细胞［5］，且能明显改善脑外伤［6］、脑梗死［7］、脊髓损伤［8］等神经系统疾病动物模型的神经功能。然而，现有的体内外研究均难以解释低比例人脐血细胞分化为神经细胞如何发挥明显的促进神经功能恢复。因此，人们推测人脐血细胞除了通过分化为神经细胞发挥细胞替代作用之外，其修复神经损伤的机制还可能与分泌某些细胞因子的神经保护作用有关［9］。

神经营养因子是在神经元细胞的发育、生长和成熟神经元功能的维持中发挥关键作用的一类蛋白质，其中GDNF、BDNF、NGF、NT-3、NT-4/5 是研究最广泛的5 种神经营养因子。NGF 是人们发现的第1种神经营养因子，对交感和感觉神经元的存活和维系至关重要，并可促进轴突生长［10］。随后研究者又发现，BDNF 具有促进中枢和外周神经系统现有神经元存活、促进新生神经元和轴突生长及分化的作用［11］。NT-3 是人们发现的第3 种神经营养因子，与NT-4/5 分 别 通 过TrkC 和TrkB 受 体 结 合，发挥促进神经元存活、增殖及轴突再生的作用［12］。GDNF 是一种能够促进多巴胺能神经元和运动神经元存活的小分子蛋白，是第1个被发现并命名的GDNF 家族成员［13］。

本研究显示，UCB-MNCs 中的GDNF、BDNF、NGF、NT-3、NT-5 mRNA 表达 水平 均 高 于APBMNCs，UCB-MNCs 培养液上清中的BDNF、NT4/5 分泌水平，分别约为APB-MNCs的5、4 倍。由此我们推测，UCB-MNCs 中的神经营养因子高表达和分泌可能是其修复神经损伤的机制之一，将来有必要在神经系统疾病的动物模型中对该机制进行更加深入的研究。

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