高血糖条件下神经降压素调节巨噬细胞炎症反应的实验研究

张慧宇，郭敏芳，刘 华，张艳霞

（1.山西大同大学医学院中医系，山西大同037009；2.山西大同大学医学院组胚教研室，山西大同037009）

高血糖条件下神经降压素调节巨噬细胞炎症反应的实验研究

张慧宇1，郭敏芳2，刘 华2，张艳霞2

（1.山西大同大学医学院中医系，山西大同037009；2.山西大同大学医学院组胚教研室，山西大同037009）

目的观察神经降压素在高血糖条件下对巨噬细胞的影响。方法取昆明小鼠脾巨噬细胞，高糖培养液培养15 d，细胞分PBS对照组和神经降压素干预组。ELISA检测法检测TNF-、IL-1β及IL-6的释放；RT-PCR检测TNF-、IL-1β及IL-6mRNA的表达。结果高糖条件下神经降压素能降低巨噬细胞TNF-、IL-1β及IL-6的释放和mRNA的表达（P＜0.05）。结论在高糖条件下，神经降压素可以通过抑制炎性细胞因子的释放影响巨噬细胞的反应。

高血糖；神经降压素；巨噬细胞炎症反应

糖尿病的特点是血糖的动态平衡受损，在世界上影响着数以百万计的人[1]。糖尿病可以导致四肢的血液循环不良，特别是在有神经病变的人，长期的糖尿病能破坏免疫系统，增加患者感染率的发生，其中慢性足溃疡是糖尿病最常见、最有代表性的并发症之一，这种疾病影响的糖尿病人口约15％[2]。糖尿病足溃疡可以减少体力活动，严重情况下可导致下肢截肢。事实上，与糖尿病患者高血糖并发的有白细胞功能受损[3]，有研究发现，通过给胰岛素使血糖水平正常化可以改善并最终恢复中性粒细胞的活性和功能[4]。糖尿病创面组织中炎性细胞因子和抗炎细胞因子的失衡影响炎症反应以及随后的愈合过程[5]，而巨噬细胞在调节反应的过程中发挥着至关重要的作用。

研究表明，在创面修复反应过程中，神经内分泌系统可以调节伤口愈合，特别是通过神经肽，比如P物质和神经降压素[6]。神经降压素具有广泛的生物学功能，它可以调节免疫反应，因为它能与白细胞和树突状细胞相互作用，刺激细胞因子的释放和趋化，特别是在调节巨噬细胞的功能过程中发挥着重要的作用[7]。此研究的目的主要观察神经降压素在高血糖条件下对巨噬细胞的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

昆明小鼠取自山西大同大学医学院动物中心；神经降压素购自Sigma公司；Trizol试剂购自Gibco-BRL公司；M-MLV逆转录酶购自Promega公司；TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA测定试剂盒购自Pepro Tech公司；GADPH、TNF-α、IL-1β和IL-6引物由生工生物提供；MTT试剂购自Sigma公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清购自Gibco-BRL公司。

1.2 方法

1.2.1 巨噬细胞的分离和培养

无菌条件下处死昆明小鼠并分离脾脏，40μm滤网研磨脾脏制备细胞悬液，1 500 r/min离心，然后裂解红细胞，PBS洗3次，用含10％胎牛血清的DMEM培养液重悬，CO2培养箱中培养1 h，弃掉不贴壁的T淋巴细胞，贴壁的即为巨噬细胞。巨噬细胞在含有30μm ol/L的D-葡糖糖的培养液中培养15 d，然后干预组加10 n mol/L的神经降压素，对照组加等量的PBS，继续培养24 h。

1.2.2 巨噬细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的检测

收集巨噬细胞培养上清液，按ELISA检测试剂盒说明书进行操作，在酶标仪上读取不同浓度TNF-α、IL-1β和IL-6标准品相应的光密度值（A450），绘制出标准曲线，然后参照各细胞因子的标准曲线计算出TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，结果以pg/mL计量。

1.2.3 逆转录聚合酶链反应检测巨噬细胞TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的表达

收集用Trizol法提取的细胞总RNA，紫外分光光度计测定A260/A280为1.8～2.0，证实RNA纯度符合RT-PCR反应要求。以总RNA为模板，用Oligo-d（T）18为引物逆转录合成第一链cDNA，特异性引物分别扩增 TNF-α、IL-1β、IL-6和GADPH。TNF-α引物序列为上游5＇-CAAGGGACTAGCCAGGAG-3＇，下游 5＇-TGCCTCTTCTGCCAGTTC-3＇；IL-1β引物序列为上游5＇-ACCTGTCCTGTGTAATGAAAG-3＇，下游5＇-GCTTGTGCTCTGCTTGTG-3＇；IL-6引物序列为上游5＇-TTCCATCCAGTTGCCTTC-3＇，下游 5＇-TTCTCATTTCCACGATTTCC-3＇；GADPH引物序列为上游5＇-CAGTGGCAAAGTGGAGATTGTTG-3＇，下游5＇-CTCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3＇。PCR反应条件为94℃预变性15min，94℃变性15 s，60℃退火25 s，72℃延伸20 s，共55个循环，最后72℃延伸5min，1.5％琼脂糖凝胶电泳PCR产物。实验重复3次，用Qautity One软件分析iNOS和TLR4与GADPH的PCR产物灰度值，以二者比值来表示TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的相对表达量。

2 结果

2.1 高糖条件下NT抑制巨噬细胞TNF-α、IL-1β和IL-6的释放

采用ELISA法测定巨噬细胞培养上清液中的炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6（图1），结果显示NT降低高糖条件下巨噬细胞释放的TNF-α、IL-1β和IL-6，比对照组显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果表明，NT在高糖条件下抑制巨噬细胞的炎性反应。

图1 ELISA检测NT对高糖条件下巨噬细胞产生TNF-α，IL-1β和IL-6的影响

2.2 高糖条件下NT降低巨噬细胞TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表达

提取细胞RNA，采用RT-PCR法检测巨噬细胞TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的表达 （图2），结果表明高糖条件下NT抑制巨噬细胞TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的表达，比对照组显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与ELISA结果相一致。

图2 RT-PCR检测NT对高糖条件下巨噬细胞表达TNF-α、IL-1β和IL-6 m RNA的影响

3 讨论

血小板、中性粒细胞、成纤维细胞和巨噬细胞释放细胞因子、白介素和生长因子促进伤口的愈合，这些重要的细胞介质调节愈合阶段的炎症反应，特别是巨噬细胞在炎症和免疫过程中发挥重要作用。生理和病理事件可以被激活，并最终被神经肽调节，比如P物质和神经降压素[8]。

在高糖条件下，巨噬细胞表达炎性细胞因子的模式会被影响。糖尿病能诱导免疫细胞多种细胞因子的表达，比如TNF-α和IL-6[9]。IL-6由T细胞和巨噬细胞分泌，并作为一个促炎性细胞因子刺激免疫反应。TNF-α是巨噬细胞分泌的一种重要炎性细胞因子，并且单核细胞中有低水平的表达。IL-1β是由激活的巨噬细胞产生的炎症反应过程中重要的介质，它参与多种细胞活动，包括细胞增殖、分化和细胞凋亡[10]。

神经降压素是广泛分布于脑组织和胃肠道的生物活性肽，能调节广泛的生物学效应，比如胃肠道系统和肺的炎症反应过程，它可以通过和巨噬细胞直接作用而抑制细胞因子的产生和iNOS的表达，证明神经降压素在炎症时有一定的保护作用。在我们的实验中，在30mmol/L葡糖糖条件下，NT能使巨噬细胞TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表达降低，说明在高糖条件下，NT通过调节细胞因子的表达抑制巨噬细胞的炎性反应，这些影响有可能在糖尿病患者的伤口愈合过程中是有益的。

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〔责任编辑 杨德兵〕

The Experimental Study of Neurotensin M odulating the Inflammatory Response of M acrophages under Hyperglycem ic Conditions

ZHANG Hui－yu1，GUO Min－fang2，LIU Hua2，ZHANG Yan－xia2
（1.Departmentof Traditional Chinese Medicine，Medical School of ShanxiDatong University，Datong Shanxi，037009；2.Department of Histology and Embryology，Medical School of ShanxiDatong University，Datong Shanxi，037009）

Objective To observe the effect of Neurotensin（NT）in macrophages function under hyperglycemic conditions.Methods Macrophageswere prepared from spleen of Kunmingmice and incubated in 30μmM（high glucose）D－glucose，for 15 days.The cells were divided into the PBS control group and Neurotensin treatment group.The level of TNF－α、IL－1βand IL－6 was detected by ELISA；ThemRNA expressions of TNF-α、IL-1βand IL-6 were detected using RT-PCR.Results：NT can decrease the release of TNF-α、IL-1βand IL-6 inmacrophages under hyperglycemic conditions（P＜0.05）.Conclusion These studies demonstrate that NT through the regulation of inflammatory cytokine expression affectsmacrophage responses.

hyperglycemic；neurotensin；inflammatory response ofmacrophages

R587.1；R392.1

A

1674-0874（2013）06-0042-04

2013-08-08

山西大同大学2011年度青年科学研究基金项目［2011Q13］

张慧宇（1979-），男，山西原平人，硕士，助教，研究方向：中医临床。