TLR-5在溃疡性结肠炎中的表达及相关性研究

马小芬，黄重发，朱 清，裴小红，卜全慧，周 怿

1.南京中医药大学，江苏 南京 210029;2.中国人民解放军第454医院消化内科

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种病因及发病机制尚未完全明确的肠道非特异性炎症，目前认为UC是一种自身免疫性疾病，肠道黏膜免疫系统异常反应导致的炎性反应在UC的发病中起重要作用。近年研究发现哺乳动物Toll样受体(Toll like receptors，TLRs)介导的信号转导通路参与了UC的发生发展。TLR-5是机体免疫系统识别细菌鞭毛蛋白的受体，TLR-5与鞭毛蛋白结合后介导机体针对病原菌的先天性免疫反应及炎症反应。TLR-5在正常下消化道IECs中结构性表达，但尚不明确TLR-5是否参与了UC的发病。本研究通过检测TLR-5、NF-κB在UC中的表达水平及表达相关性，探讨TLR-5、NF-κB信号通路在UC发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2008年2月-2012年4月活动期UC患者50例，所有患者均符合2007年中华医学会炎症性肠病协作组制定的UC诊断标准［1］。50例患者根据Southerland疾病活动指数(CAI)［2］分为轻度、中度、重度三组。同时选取30名行肠癌筛查的健康志愿者作为对照组。入组患者均无严重并发症，包括心、肝、肾疾病和系统性疾病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等，并除外使用非甾体抗炎药及乙醇成瘾者。各组间年龄、性别、病程及吸烟人数均无统计学差异(见表1)。该研究通过中国人民解放军第454医院伦理委员会批准并取得所有入组患者的知情同意。

1.2 标本收集、RNA及蛋白的提取 所有入组患者均在病变最明显的肠段黏膜溃疡边缘或充血水肿最明显处多点取材，健康对照者均在直肠处取材。一部分结肠组织给予液氮快速冷冻后置-80℃保存，根据试剂盒说明书提取RNA(Vitrogen，美国)行实时荧光定量RT-PCR检测，紫外分光光度计测定RNA含量及纯度，并证实其A260/A280为1.8～2.0。另一部分组织提取核蛋白(Cayman，德国)。

1.3 RT-PCR检测 TLR-5及GAPDH引物的设计参照GeneBank序列，应用Primer Express 2.0软件设计，确定的序列由上海生物工程技术服务有限公司合成。引物序列为:TLR-5sense:5'-TCAAACCCCTTCAGAGAATCCC-3'，antisense:5'-TTGGAGTTGAGGCTTA GTCCCC-3';GAPDH sense:5'-CCTCAAGATCATCAGCAAT-3'，antisense:5'-CATCCACAGTCTTCTGGGT-3'。PCR反应条件:TLR-5为94℃ 20 s、54℃ 20 s、72℃30 s、80 ℃ 20 s、45 个循环;GAPDH 为 94 ℃ 20 s、54℃ 20 s、72℃ 30 s、80℃ 20 s，45个循环。5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察、拍照。

表1 UC各组与对照组的一般资料Tab 1 Characteristics of UC groups and control group

1.4 ELISA检测核内NF-κB结合活性 应用Cayman NF-κB(Cayma，德国)活性检测试剂盒测定 NF-κB的活性。该方法将胞核内能与p65结合的DNA片段包被于96孔板上，取核蛋白等量分别加入孔内，每组做三个复孔，设置空白对照、非特异性结合对照、竞争性dsDNA结合对照及阳性对照。4℃过夜，次日洗板，并加入 NF-κB 一抗(1∶100)、二抗(1∶100)分别于室温孵育1 h及显色液，最后于波长450 nm酶标仪检测A值。

1.5 统计学处理 所得实验数据采用SPSS 13.0统计软件进行分析。所得计量资料用表示。经方差齐性检验及正态性检验后，计量资料两组间差异采用t检验;多组数据比较采用单因素方差分析(One-Way，ANOVA)，各指标间的相关性分析采用Person相关性检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TLR-5 mRNA在结肠黏膜组织中的表达 如图1所示:随着UC严重程度的加重，结肠黏膜组织中的TLR-5 mRNA表达量逐渐增加，中度UC组较对照组比较TLR-5 mRNA表达量明显增加，差异具有统计学意义(1.22 ±0.32 vs 0.6 ±0.12，P ＜0.05)，重度 UC 组与对照组比较差异也具有统计学意义(2.15±0.15 vs 0.6 ±0.12，P ＜0.05)。

2.2 NF-κB在结肠黏膜组织中的转录活性 如图2所示:NF-κB活化后从胞浆进入细胞核内与其靶基因结合并调节其转录。ELISA结果显示UC患者结肠黏膜组织中NF-κB转录活性明显增加，随着UC严重程度的加重，NF-κB转录活性逐渐增加，中、重度UC组与对照组比较差异具有统计学意义(0.53±0.08、0.87 ±0.12、0.2 ±0.05，P ＜0.05)。

图1 TLR-5 mRNA在结肠黏膜组织中的表达 (与对照组比较，*P ＜0.05)Fig 1 Expression of TLR-5 mRNA in colorectal mucosal tissues (Compared with control group，*P ＜0.05)

图2 NF-κB在结肠黏膜组织中的转录活性 (与对照组比较，*P ＜0.05)Fig 2 The transcriptional activity of NF-κB in colonic mucosal tissues (Compared with control group，*P ＜0.05)

2.3 TLR-5与CRP及ESR之间的相关性 UC中血浆ESR及CRP的含量与疾病的严重程度成正比(见表1)，两者是目前临床比较实用的判断UC活动性的指标，UC患者结肠黏膜中TLR-5 mRNA的表达与血浆中的CRP呈正相关(r=0.78，P=0.02)，结肠黏膜中TLR-5 mRNA的表达与血浆中的ESR表达也呈正相关(r=0.85，P=0.001)。

3 讨论

肠道黏膜免疫系统异常在UC发病中起着重要作用。随着黏膜免疫系统的深入研究发现Toll样受体介导的信号转导通路参与了UC的发生发展。TLRs在UC中的作用目前已成为肠道疾病研究的又一热点。近年研究发现，TLR-5可以介导多种炎症因子的表达，可能参与UC的发病［3］。TLR-5是机体免疫系统识别细菌鞭毛蛋白的受体，TLR-5与鞭毛蛋白结合后进一步激活核转录因子NF-κB而刺激TNF、IL-1、IL-8等前炎症细胞因子的产生从而介导机体针对病原菌的先天性免疫反应及炎症反应［4］。Sánchez-Muñoz 等［5］研究表明，TLR-5在UC患者肠道黏膜上皮细胞高表达，且与疾病严重程度、炎性因子(IL-6和TNF)表达呈正相关。我们的研究结果与该研究结果相一致，TLR-5 mRNA在UC中明显高表达，与疾病严重程度、ESR及CRP呈正相关。同时，我们也检测到NF-κB在UC中转录活性增强，且与疾病严重程度明显相关。本研究提示TLR-5可能通过活化NF-κB刺激炎症因子的表达从而参与UC的发病。但是在我们研究中发现，轻度UC患者TLR-5 mRNA表达量与对照组无统计学差异，而NF-κB转录活性却显著增加，两者表达情况并不完全一致，其原因可能是除了TLR-5以外，TLR-2、TLR-4、TLR-8 等［5-7］TLRs家族成员均参与了 UC 的发病过程中，它们可通过不同的信号传递通路活化NF-κB诱导炎症因子的表达。

综上所述，TLR-5在UC中高表达，可能通过诱导NF-κB活化，增加炎症因子的转录和表达，从而参与UC的发病。因此，通过干预TLR-5信号传导通路可能为UC治疗提供新的靶点。同时，TLR-5与疾病严重程度、炎症指标均具有很强的相关性，检测TLR-5可用于UC活动性的评价指标。

［1］Cooperative Group of Inflammatory Bowel Diseases of Digestive Disease of Chinese Medical Association.Consensus of China’s inflammatory bowel disease diagnosis and treatment standard［J］.Chin J Gastroenterol，2007，27(2):545-550.中华医学会消化病学分会炎症性肠病协作组［J］.中华消化杂志，2007，27(2):545-550.

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［3］Li GX，Li N.Toll like receptors on intestinal barrier is protection or damage［J］.Chin J Gastrointest Surg，2009，12(5):540-541.李国逊，李宁.Toll样受体对肠屏障是起保护作用还是损害作用［J］.中华胃肠外科杂志，2009，12(5):540-541.

［4］Vijay-Kumar M，Aitken JD，Gewirtz AT.Toll like receptor-5:protecting the gut from enteric microbes［J］.Semin Immunopathol，2008，30(1):11-21.

［5］Sánchez-Muñoz F，Fonseca-Camarillo G，Villeda-Ramírez MA，et al.Transcript levels of Toll-like receptors 5，8 and 9 correlate with inflammatory activity in ulcerative colitis［J］.BMC Gastroenterol，2011，11:138.

［6］de Paiva NM，Ayrizono ML，Milanski M，et al.Differential expression of TLR2，TLR4 and JNK in mucosa of ileal pouches for ulcerative colitis［J］.Int J Clin Exp Med，2011，4(3):179-186.

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