实时荧光RT-PCR在人感染H7N9禽流感病毒检测中的应用

华哲云，褚 维，宋黎黎，王 宇，高淑娜，劳宝法

(上海市黄浦区疾病预防控制中心，上海 200023)

2013年4月1日，中国国家卫生和计划生育委员会向世界卫生组织(WHO)通报了3例人感染H7N9禽流感病例。引起此次疫情的H7N9禽流感病毒[avian influenza A(H7N9)virus 2013]是一种新型的重组禽流感病毒，其基因组8个片段中血凝素(hemagglutinin，HA)基因来自北京燕雀 A(H7N3)，神经氨酸酶(neuraminidase，NA)基因来自韩国野禽A(H7N9)，其余6个基因片段均来自浙江鸭A(H9N2)[1]。人感染H7N9禽流感病情发展迅速，可快速进展为急性呼吸窘迫综合征，死亡率极高[2]。由于人感染H7N9禽流感临床症状的非特异性，对疫情的确诊和控制只能依赖于实验室的检测结果，所以建立一套稳定的H7N9病毒核酸实验室检测方法是疫情防控的关键。为此，我们对4种不同的实时荧光逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂开展了检测效果比对，以确立检测方法并提供更可靠的实验结果，同时还分析了不同标本的病毒核酸检出情况，为今后不明原因肺炎及禽流感病例监测的采样工作提供建议。

材料和方法

一、对象

1.病例定义 人感染H7N9禽流感监测病例需同时具备以下4项条件:(1)发热(腋下体温≥38℃以上;(2)具有肺炎的影像学特征;(3)发病早期白细胞总数降低或正常，或淋巴细胞分类计数减少;(4)不能从临床或实验室角度诊断为常见的病原所致肺炎[3]。

2.标本类型、采集、保存和运输 及时采集患者上呼吸道标本(鼻咽拭子、鼻腔抽取物、咽漱液和鼻洗液等)和下呼吸道标本(气管吸取物、肺泡灌洗液、痰液等)。拭子标本采集使用塑料杆的聚酯纤维拭子，采集后的标本置于3 mL病毒采样液中，4℃保存，并使用生物安全转运装置及时将标本送至本实验室。从2013年4月1日至5月8日，一共收到137例人感染H7N9禽流感病毒的临床监测及可疑病例标本。

二、检测方法

1.病毒核酸的抽提 吸取140 μL标本液，加入套管内，置于QIAcube全自动核酸纯化系统中，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒(德国QIAGEN公司)配套程序进行病毒核酸的提取，抽提产物存储于100 μL无RNA酶水中，4℃保存待检。

2.病毒核酸的检测 在ABI7300荧光定量PCR检测仪(美国Life Technologies公司)上使用4种实时荧光RT-PCR试剂对标本进行检测。其中1种为国家流感中心(CNIC)下发引物探针配合Superscript III platinum one-step qRT-PCR system试剂盒(美国Invitrogen公司)进行病毒的核酸检测，引物探针序列信息见表1，反应体系配制见表 2。反应程序为 45℃ 10 min、95℃10 min、(95℃ 15 s、60℃ 45 s)×40循环，60 ℃采集核酸扩增荧光信号[4];另3种为市售商品化试剂盒(简称A、B和C)，反应体系配制及程序设置均按照试剂盒推荐方法进行操作。

三、统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。对4种试剂的平均Ct值使用Friedman检验(氟里得曼双向评秩方差分析)。P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 引物探针序列

表2 反应体系配制

结 果

一、H7N9禽流感病毒阳性检出率

137例临床标本中检出5例阳性，阳性率为3.65%(5/137)。4种荧光定量RT-PCR试剂检测阳性结果完全相符。人感染H7N9禽流感病毒核酸检测阳性曲线见图1。

二、4种试剂的检测效果评估

比较5例H7N9禽流感病毒核酸阳性标本的检测Ct值。A试剂盒的Ct值低于其他试剂(P=0.025)，见表 3。

图1 CNIC下发引物探针检测H7N9禽流感病毒阳性扩增曲线

表3 4种试剂平行检测H7平均Ct值比较

三、不同来源标本的检测结果分析

5例阳性病例分别在不同标本中检出。上呼吸道标本阳性检出率为60%(3/5)，下呼吸道标本检出率为100%(5/5)，检出情况见表4。

表4 不同来源标本检测结果的比较

讨 论

H7N9禽流感病毒是一种新型重组的甲型流感病毒，2013年2月在中国华东地区首发并呈高度散发状态。截至2013年5月17日，全国共发生人感染H7N9禽流感确诊病例131例[5]。人感染H7N9禽流感发病初期为常见的流感样症状，但其病程进展迅速，可在5～7 d内发展成重症肺炎，甚至并发急性呼吸窘迫综合征，死亡率极高。目前我国人感染H7N9禽流感死亡病例为36例，死亡率高达27.5%。由于此疾病没有特异的临床症状，需要借助实验室检测结果与其他严重急性呼吸道感染疾病进行鉴别诊断，所以快速准确的实验室检测方法是此次疫情防控和临床救治的关键。实时荧光RT-PCR技术作为一项快速、高度敏感、高度特异和可高通量检测的新型技术已广泛应用于病原微生物核酸的检测，对于此次人感染H7N9禽流感病毒疫情的实验室检测也是首选的方法。作为国家级流感检测网络实验室，上海市黄浦区疾病预防控制中心微生物实验室在此次疫情的处置工作中，应用实时荧光RT-PCR进行了人感染H7N9禽流感病毒的核酸检测。

本研究应用CNIC下发的引物探针和3种市售商品化H7N9禽流感病毒核酸检测试剂盒同时进行了标本的检测，并对检测效果进行评估，以确立本实验室的检测方法，为疫情防控和临床治疗提供稳定可信的检测结果。检测结果显示，目前3种市售商品化试剂盒与CNIC下发引物探针的检测结果符合率为100%。4种试剂均能有效检测出H7N9禽流感病毒核酸。由于A试剂盒在其扩增程序中增加了5个循环的预扩增，其最终的检测结果Ct值均低于其他试剂盒Ct值，所以在核酸含量较低的情况下，使用A试剂盒更易判断检测结果。

宋黎黎等[6]报道，不同采样部位的标本其流感病毒的检测结果存在差异。本研究比较了不同采样部位标本的H7N9禽流感病毒核酸检测效果。在5例阳性标本中，共收集了5份上呼吸道标本(鼻咽拭子)和3份下呼吸道标本(痰液及肺部灌洗液)，结果发现下呼吸道标本的阳性检出率更高，为100%(3/3)，而上呼吸道标本的阳性检出率为60%(3/5)。说明H7N9禽流感病毒与其他禽流感病毒相似，对人下呼吸道更为敏感[7-8]。因此，在今后的不明原因重症肺炎，特别是禽流感疑似病例的监测采样中，建议在有条件的情况下尽量采集患者的下呼吸道标本，以提高病毒核酸的阳性检出率。

[1]Gao R，Cao B，Hu Y，et al.Human infection with a novel avian-origin influenza A(H7N9)virus[J].N Engl J Med，2013，368(20):1888-1897.

[2]Li Q，Zhou L，Zhou M，et al.Preliminary report:epidemiology of the avian influenza A (H7N9)outbreak in China [J].N Engl J Med，2013[Epub ahead of print].

[3]中国国家卫生和计划生育委员会.人感染H7N9禽流感诊疗方案(2013年第2版)[EB/OL].(2013-04-11)[2013-06-10].http://www.gov.cn/gzdt/2013-04/11/content_2374926.htm.

[4]World Health Organization.WHO CC Beijing real-time RT PCR(rRT-PCR)protocol for detection of a(H7N9)avian influenza virus(Version 22013)[EB/OL].(2013-04-15)[2013-06-10].http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/cnic_realtime_rt_pcr_protocol_a_h7n9.pdf.

[5]World Health Organization.Human infection with avian influenza A(H7N9)virus– update[EB/OL].(2013-05-17)[2013-06-10].http://www.who.int/csr/don/2013_05_17/zh/index.html.

[6]宋黎黎，赵百慧，褚 维，等.采用PCR和细胞培养方法比较流感样病例不同标本的流感病毒检出情况[J].中国卫生检验杂志，2013，23(4):892-895.

[7]张增峰，樊晓晖，李康生，等.人呼吸道禽流感病毒受体的分布趋势[J].生物化学与生物物理进展，2008，35(12):1387-1393.

[8]张增峰，樊晓晖，陈晓燕，等.禽流感病毒H9N2在人肺组织的复制[J].病毒学报，2013，29(2):206-210.