网织红细胞血红蛋白量和低色素红细胞百分比检测在孕妇缺铁性贫血筛检中的作用

蔡 眉，费新娣

(上海交通大学医学院附属中国福利会国际和平妇幼保健院，上海 200030)

妊娠早期贫血会引起胎盘激素的释放，例如促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质醇(cortisol)，继而引发子宫收缩并阻断胰岛生长素(IGF)的释放，IGF是胎儿生长发育重要的合成代谢激素。贫血和缺氧也可影响胎盘的生长发育，例如非正常的胚胎滋养层入侵和组织缺氧因子(HIF)的释放[1]。

贫血患者循环血量的减少而导致早产、低体重儿出生率增高或最终增加产后输血的几率[2]。妊娠早期贫血以缺铁性贫血(IDA)最常见。骨髓铁染色是诊断铁缺乏的金标准，但具创伤性且存在取样误差，不易被孕妇本人及家属接受[3]，临床上对于缺铁的筛查，传统方法主要依赖于常规血液学参数和铁代谢指标，但是铁蛋白等生化指标的检测较昂贵、费时，影响因素较多，结果具有一定的局限性。近年来，随着全自动血液分析系统的不断更新，具备网织红细胞(RET)流式细胞仪法可检测网织红细胞血红蛋白含量(CHr)和低色素性红细胞百分率(Hypo%)。CHr的检测被认为是早期诊断铁缺乏敏感、特异的指标，而国内对Hypo%的研究较少，我们在结合传统IDA诊断指标的基础上，对CHr和Hypo%进行重点实验以探讨两者在单独及联合试验中对IDA的诊断意义。

材料和方法

一、研究对象

研究对象为上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院2008年10月至2009年1月门诊产科初诊孕妇(孕周12～16周)，在本院均经心电图、B超、实验室检查无异常者(肝、肾功能、血糖正常，甲、乙、丙、戊肝炎病毒指标阴性、抗体除外，血常规白细胞(WBC)计数(4.0～10.0)×109/L且中性粒细胞百分比50% ～70%，血小板(PLT)计数(100～300)×109/L，年龄21～40岁。

1.贫血组 贫血患者Hb＜110 g/L为238例。其中:(1)IDA孕妇组(妊娠期Hb＜110 g/L和血清铁＜10.7 μmol/L的孕妇):78例。妊娠期IDA诊断标准参照《妇产科学》国内标准及《全国临床检验操作规程》(第3版):Hb＜110 g/L、血清铁(SI)＜10.7 μmol/L及外周血涂片见红细胞(RBC)有小细胞低色素性改变，具有明确的缺铁原因。排除基础性疾病及肿瘤等慢性贫血患者;(2)非IDA孕妇组(妊娠期Hb＜110 g/L和SI≥10.7 μmol/L):160 例。

2.正常孕妇组 妊娠期 Hb≥110 g/L，SI≥10.7 μmol/L 共 100 例。

二、实验方法

1.血标本采集和处理 (1)乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝血:用抗凝剂EDTA-K2真空试管(江苏康健医疗用品有限公司，规格13×75 mm)空腹采集静脉全血2 ml，EDTA-K2浓度为1.8 ～2.2 mg/mL，轻轻颠倒混匀8～10 次;室温3 h内完成全血细胞计数及CHr测定;余样6 h内以Hb及 SI对IDA的临界值制备血涂片;(2)血清:用无添加的真空试管(江苏康健医疗用品有限公司，规格13×100 mm)空腹采集静脉全血5 mL，置室温 1.5～2 h完全凝固后，以 3500～4000×g离心5 min，分离血清，6 h完成血清铁的测定。

2.检测仪器和试剂 (1)ADVIA2120血液分析仪(德国BAYER医疗诊断设备有限公司生产);标准品(德国BAYER医疗诊断设备有限公司生产)、质控品(上海市临床检验中心质控品及仪器配套全血五分类质控品)和配套试剂(德国BAYER医疗诊断设备有限公司生产);(2)日立7180全自动生化仪(日本日立公司生产)，标准品及质控品(美国德灵诊疗用品公司生产);SI试剂盒(英国朗道 RANDOX公司生产);(3)瑞-吉(Wright-Giemsa)染色液(珠海贝索生物技术有限公司提供);(4)光学显微镜:OLYMPUS光学显微镜，型号CX-41(日本奥林巴斯集团提供)。

3.检测方法 (1)全血细胞计数及CHr测定:ADVIA2120血液分析仪每半年由厂家统一校准，并进行校准验证;在校准有效期内参加上海市临床检验中心的全市室间质量评价，结果合格。每日检测临床标本前采用上海市临床检验中心及仪器配套质控品进行室内质量控制，标本严格按照仪器操作规程进行检测。对于仪器报警、检测结果有各种异常的标本进行重复测定，必要时镜检复核。各项血细胞检测参数包括CHr、RBC、Hb、Hypo%、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞分布宽度(RDW)、网织红细胞百分比(Ret%);(2)SI测定:日立7180全自动生化仪每年由厂家统一校准，并进行校准验证;在校准有效期内参加上海市临床检验中心的全市室间质量评价，结果合格。每日检测临床标本前采用高、低两质控品进行室内质量控制。标本严格按照仪器操作规程进行检测;(3)血涂片检查:具有临床检验中级任职资质并在血常规岗位超过10年的工作人员，按《全国临床检验操作规程》(第3版)的要求以抗凝全血制备1张良好的血涂片，进行瑞特染色，自然干燥后用高倍镜(必要时油镜)观察RBC形态，统计低色素小红细胞的百分比(约观察500个RBC)。参照《全国临床检验操作规程》(第3版)的标准，以RBC大小不均，小细胞为主，有明显的中心淡染区扩大来判断异常RBC的形态和数量。

三、统计学方法

结 果

一、全血RBC参数测定结果

IDA 组的 RBC、Hb、Hypo%、MCV、MCHC、MCH、RDW与非IDA组和正常孕妇组比较差异有统计学意义(P均＜0.05)。非IDA组Hypo%、MCH、Hb与正常孕妇组比较差异有统计学意义(P均＜0.05);其余项目2组间差异无统计学意义(P ＞0.05)，见表1。

表1 3组RBC参数检测结果比较

二、各组CHr、Ret%及SI结果比较

IDA组的CHr、SI均低于非IDA组及正常孕妇组(P＜0.001);非IDA组3项指标与正常孕妇组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。Ret%3组间差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表2 3组CHr、SI和Ret%检测结果比较

三、各参数不同临界值对IDA的诊断效率

按照《妇产科学》国内标准及《全国临床检验操作规程》(第 3版)选择 CHr、Hypo%、RDW、MCV、MCH临界值并计算各参数对IDA的诊断效率。结果显示在CHr＜29.0 Pg对IDA的诊断灵敏度为81%，特异性93%，诊断效率89.3%;在Hypo%≥6%分别为78%和95%，诊断效率为89.5%，略高于CHr。同时符合两者条件时灵敏度72%，而特异性高达99%，大大提高诊断的准确性。MCV、MCH、RDW三者灵敏度均明显低于CHr和Hypo%。诊断特异性除RDW外，其余参数与CHr和Hypo%无差异。CHr的临界值越低，其灵敏度越低，特异性越高;Hypo%的临界值越高，其灵敏度越低，特异性越高，在Hypo%≥8%时其特异性达到100%。

四、血涂片检查结果

选择 Hb＜110 g/L 和 SI＜10.7 μmol/L 的标本共100例，用高倍镜(必要时油镜)观察RBC形态，其中有78例标本镜下显示RBC形态明显大小不均，小细胞为多见，约占40% ～85%且有明显的中心淡染区扩大，此78例定为IDA组;选择Hb＜110g/L和 SI≥10.7μmol/L的标本共 170例，其中160例镜下RBC形态无明显异常，余下10例镜下RBC形态大小不一，此160例定为NIDA 组;选择 Hb≥110g/L 和 SI≥10.7μmol/L的标本共100例，镜下RBC形态均无明显异常，此100例为正常对照组。

五.ROC曲线

以灵敏度为纵坐标，特异性为横坐标，给出了各种参数在曲线下的面积(W)和标准误(SE)。ROC曲线面积最大者为Hypo%，W=0.933，标准误 SE=0.019，P ＜ 0.0001;其次为 CHr，W=0.929，标准误 SE=0.019，P ＜0.0001;MCV 为 W=0.911，SE=0.021，P ＜ 0.0001;MCH、MCV、RDW 均为 W=0.778，SE=0.031，P ＜ 0.0001，ROC曲线见图1～2。

图1 CHr、MCV、MCH 诊断孕妇IDA的ROC曲线分析

图2 Hypo%、RDW诊断孕妇IDA的ROC曲线分析

讨 论

IDA的定义是正常人体内的储存铁缺乏或超出需求引起的血细胞容积持续性降低而导致的Hb浓度下降，属小细胞低色素性贫血，是最常见的营养缺如之一[4]。妊娠期IDA是由于胎儿生长发育及妊娠期血容量的增加，对铁的需要量增加，孕妇对铁摄取不足或吸收不良所引起。正常成年妇女体内铁总量在2～2.5 g，一般储存的有效铁为300 mg，怀孕后增至1 g，其中包括胎儿和胎盘所需的300 mg以及排泄掉的200 mg，另外怀孕期血容量平均扩充至50%，世界卫生组织(WHO)建议在孕早期需额外补充60 mg/d的铁剂预防IDA的发生[4]。缺铁过程分3个阶段，首先铁缺少但Hb仍处于正常水平(铁缺乏ID);随着铁进一步缺少，Hb水平开始降低但红细胞压积仍保持正常(缺铁性红细胞生成期IDE);最后导致IDA的发生。孕妇IDA的发生率与所处的社会经济、营养保健有密切关联，发达国家约有19%～44%的孕妇铁缺乏但Hb仍处于正常水平，6% ～28%的孕妇患有IDA;发展中国家高达75%的孕妇患有IDA。妊娠期IDA也可能与早孕反应恶心呕吐等原因有关，因饮食受限，铁的吸收量减少;同时胃肠道功能差，没有及时增加含铁食物或者适当补充铁剂所引起，或者也有遗传的因素等[4]。

临床上对于缺铁的筛查，传统方法主要依赖于常规血液学参数和铁代谢指标，骨髓铁染色是诊断铁缺乏的金标准[3]，但具创伤性，不易被孕妇接受，不能作为常规诊断指标使用。传统RBC指标如MCV、MCH、MCHC在患者可能发生贫血甚至已经发生时仍然没有变化或变化很小。由于成熟RBC生存时间约120 d，每天约20 mL RBC被更新(相当于血循环的1%)，限制了RBC各项指标(如MCV、MCH、MCHC)及时反应其活性变化的能力，如MCV是平均红细胞体积，小体积RBC要达到一定比例才足以明显影响这个指标[9]，因此，仅根据 Hb、MCV、MCH、MCHC 极易漏诊早期铁缺乏。目前实验室推荐有血清铁蛋白(SF)、转铁蛋白(sTfR)、SI、CHr、Hypo% 的检测，然而在某些情况下如潜在感染，SF本身是急性时相反应的标志物，生理变异较大，且易受感染、炎症、肝脏疾病以及肿瘤多种因素影响，怀孕阶段SF与其他铁参数相关性不好。本实验研究重点是CHr和Hypo在孕期IDA时的改变。CHr比RET浓度和体积更稳定，随着RET成熟其体积会缩小，Hb浓度也会随着体积的减小而增加，但RET Hb含量变化很小[5]，CHr是铁缺乏早期敏感指标，与Hb含量相关性好，本研究Hb和CHr的(r=0.516，P ＜0.001)，也印证了这一关系。Hypo在已经缺铁但还未发生贫血时就开始增加[6]，长期铁缺乏会缓慢刺激RBC使细胞内Hb浓度下降，形成低色素性RBC，而且Hypo增加不受其他因素(例如感染或炎症)干扰[7]，当Hb含量降低时，Hypo%会增加，与Hgb含量呈负相关。Bayer ADVIA2120血液分析仪通过专用鞘流系统检测参数CHr和Hypo%，两者可用于临床评估制造RBC的铁含量，监测铁及促RBC生成素(EPO)治疗进展，以及肾性贫血缺铁诊断。尤其是Hypo%参数已被美国肾脏病与透析患者生存质量指导指南收录并推荐其作为诊断IDA的检测指标。

实验结果显示，当 CHr＜29.0 pg时，其灵敏度为80%略高于Hypo%≥6%的表现78%;其特异性93%略低于Hypo%≥6%的95%;同时满足两者条件，灵敏度下降至73%，但特异性提高到99%，其余指标MCV，MCH，RDW的灵敏度和特异性均不如CHr和Hypo%的改变，说明两者可作为IDA的辅助诊断指标。以不同临界值计算，两者敏感性都不很高，但在Hypo%≥8%时特异性可达100%。国外文献报道有学者倾向首选CHr用于筛检IDA，有的则注重Hypo%，将两者联合起来的文章较少报道。国内多关注CHr而较少提及Hypo%。本研究结果认为参数Hypo%在筛检IDA时的作用并不亚于CHr，甚至其诊断效率还略优于CHr。瑞士学者 A.Krafft[7]明确阐述过 Hypo 可以作为IDA筛选的首选指标，意大利学者Nicola Tessitore[8]认为在Hypo% ＞10%时诊断IDA有绝对特异性，应首选指标Hypo%。而本实验结果Hypo%≥8%时特异性颇高，可明确辅助诊断IDA，并显示Hgb和Hypo%呈负相关(r=－0.512，P＜0.001);CHr和 Hypo%也呈良好负相关(r=－0.773，P ＜0.001)。

由于实验例数有限，在结果统计上没有很好的达到预期效果。另外在收集原始资料时，没有对初诊孕妇做到详细询问，譬如在抽血前一段时间内的饮食情况，或者是否在妊娠早期或准备怀孕之前补充过铁剂等，可能会影响检测结果(尤其是SI)，出现Hb和CHr明显下降，Hypo%明显上升，但SI含量仍然正常甚至很高的现象。在本实验N-IDA组160例中，有4例这样的情况，但是例数很少不足以说明问题。另外，鉴于我们暂不开展针对铁缺乏试验特异性高的生化指标如SF、sTfR等测定，在某种程度上可能影响我们实验分组的准确性，尽管SF不够稳定，但到目前为止其仍然是IDA的确诊试验之一。国内北京协和医院血液科李淑兰等[3]研究显示在 CHr＜29.0 pg时其灵敏为93.3%，特异性为86.7%，与本实验CHr＜29.0 pg的灵敏度80%和特异性93%有一定差异，这可能与研究对象不同和判断IDA标准不同有关(北京协和医院的研究对象是血液科患者、IDA判断标准是RBC系统参数及SF;本实验研究对象是早孕妇女、IDA判断标准是RBC系统参数及SI)。需要指出的是，参数Hypo%测定对温度，标本放置时间要求较高(一般要求3 h内测定，否则可能会引起血细胞体积变化而影响Hb浓度，继而干扰低色素红细胞检测[8])，而且只能在Bayer ADVIA系列仪器上进行检测，国内ADVIA仪器很少应用于检验科，所以极大限制了其临床应用。目前为止，国内参考文献较少查阅到关于针对参数Hypo%的实验与分析，我们的实验结果缺少与国内同行横向比较，恳请各位同行提出宝贵建议。

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[2]Engmann C，Adanu R，Lu TS，et al.Anemia and iron deficiency in pregnant Ghanaian women from urban areas[J].Int J Gynecol Obstet，2008，101(1):62-66.

[3]李淑兰，辛丽亚，张 立，等.CHr在缺铁性贫血中的诊断意义[J].中国实验诊断学，2009，13(7):930-931.

[4]Bashiri A，Burstein E，Sheiner E.Anemia during pregnancy and treatment with intravenous iron:review of the literature[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2003，110(1):2-7.

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[6]Ervasti M，Sankilampi U，Heinonen S，et al.Novel red cell Indices indicating reduced availability of iron are associated with high erythropoietin concentration and low ph level in the venous cord blood of newborns[J].Pediatr Res，2008，64(2):135-140.

[7]Krafft A，Huch R，Breymann C.Impact of parturition on iron status in nonanaemic iron deficiency[J].Eur J Clin Invest，2003，33(10):919-923.

[8]Tessitore N，Solero GP，Lippi G，et al.The role of iron status markers in predicting response to intravenous iron in haemodialysis patients on maintenance erythropoietin[J].Nephrol Dial Transplant，2001，16(7):1416-1423.

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