胶体金免疫层析试剂盒对甲型H1N1流感病毒(2009)抗原快速检测的敏感性分析

田 棣，何 静，刘 祎，张万菊，徐 磊，陈功祥，周志统，胡芸文

(1.上海市公共卫生临床中心病原体检测与生物安全部，上海 201508;2.浙江大学附属第二医院临床检验中心，浙江 杭州 310009)

流感是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，可引起地方性或世界性范围的大流行[1]。2009年4月以来，一种新型的甲型H1N1流感在全球范围内流行，引起广泛的关注和重视。在大规模爆发的流感疫情中，首先需要快速查明病原体，才能对疫情控制以及患者治疗提供帮助。目前甲型H1N1病毒(2009)的检测方法主要是逆转录(RT)聚合酶链反应(PCR)和实时荧光PCR核酸检测法[2]，但此法对技术要求高，且用时较长。而常用的胶体金免疫层析法出结果较快，操作简单，不需要特定的场所和仪器设备。基于此，本研究以实时荧光定量PCR(FQ-PCR)核酸检测结果为参考，对胶体金免疫层析试剂盒在甲型H1N1流感病毒(2009)抗原快速检测的敏感性和特异性进行了较为全面的分析。通过比较2种方法之间的相关性以及对不同病程、不同病毒核酸载量标本检测的敏感性，为甲型 H1N1流感病毒(2009)的快速筛查提供依据。

材料和方法

一、材料

1.标本与来源 标本来自上海市公共卫生临床中心2009年5至11月收治的疑似新甲型H1N1流感病例。采集标本均为鼻咽拭子，放置于带有3 mL保存液的专用标本管中，分装后－80℃低温冰箱保存。

2.试剂与仪器 RNA提取试剂盒为德国QIAGEN公司产品(QIAamp viral RNA mini kit，Cat.No.52904);FQ-PCR试剂盒选用上海科华生物工程股份有限公司的甲型通用型和甲型H1N1流感病毒(2009)RNA检测试剂盒(荧光PCR，批号为20090710);胶体金免疫层析试剂盒由杭州创新生物检控技术有限公司提供，甲型流感病毒抗原检测试剂盒批号为FA110101，甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒批号为FA110101;Mastercycler ep relplex PCR仪购自德国Eppendorf公司。

二、方法

1.FQ-PCR核酸检测和拷贝数测定 按照试剂盒产品说明书进行测定，检测通道分别为FAM(H1N1信号)及VIC(Flu A信号)。结果判断:在阴阳性对照均成立的条件下，Ct＜36为阳性;Ct≥40或无数值为阴性;36＜Ct＜40重测，复测结果Ct＜36为阳性，否则为阴性。H1N1及Flu A信号均为阳性判为甲型H1N1流感病毒(2009)阳性。

2.胶体金免疫层析法甲型流感病毒检测 按各自的说明书进行检测，直接滴入解冻标本，等待15 min即可观察结果。当试纸条判定部T、C处都确认有条带时，结果判为阳性。

三、统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件对结果进行统计分析，胶体金免疫层析法与FQ-PCR的检测结果比较采用一致性检验;检测结果与病程及核酸载量的相关性用Spearman相关分析和Logistic回归分析;用几何平均数计算核酸载量平均值;阴阳性标本的载量经对数转换后采用t检验进行平均值比较，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、胶体金免疫层析试剂盒检测与FQ-PCR核酸检测的比较

171例疑似甲型H1N1流感(2009)病例的鼻咽拭子标本，经FQ-PCR核酸检测确认甲型H1N1流感病毒(2009)阳性151例、阴性20例。以甲型H1N1流感病毒(2009)PCR核酸检测结果为标准，甲型流感病毒抗原检测试剂盒的敏感性39.1%(59/151)，特异性 90.0%(18/20);甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒的敏感性31.8%(48/151)，特异性90.0%(18/20)。甲型流感病毒抗原检测与PCR-荧光探针法核酸检测结果的一致率Pa值为45.0%，在检测结果无关联的假定下期望一致率Pe值为39.1%，Kappa值为0.098;甲型/乙型流感病毒抗原检测与PCR-荧光探针法核酸检测结果的一致率Pa值为38.6%，在检测结果无关联的假定下期望一致率 Pe值为34.2%，Kappa 值为 0.068，见表1。

二、胶体金免疫层析试剂盒对不同病程标本的检测结果比较

根据标本采集病例的发病天数将171例标本分成为1～、3～和5～d 3组，甲型流感病毒抗原试剂盒检测的阳性率分别为66.7%、32.6%和27.3%;甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒的阳性率分别为62.5%、26.1%和20.0%，见表2。2种试剂盒的检测阳性率与标本的病程均呈负相关(分别为Spearman相关系数－0.212，P ＜0.01和 Spearman相关系数为 －0.242，P ＜0.01)，且为线性关系(分别为 χ2=8.59，P ＜0.01 和 χ2=11.18，P ＜0.01)。

表1 胶体金免疫层析法和PCR的检测结果比较

表2 不同病程标本的胶体金免疫层析法检测结果

三、胶体金免疫层析试剂盒对不同病毒核酸载量标本检测的敏感性比较

1.在151例甲型H1N1流感病毒(2009)PCR核酸检测阳性标本中，胶体金免疫层析法甲型流感病毒抗原检测试剂盒检测阳性的标本核酸载量平均值为(2.41 ±1.55)×107拷贝/mL，检测阴性的标本核酸载量平均值为(1.13±1.41)×106拷贝/mL，差异有统计学意义(t=5.48，P ＜0.0001);胶体金免疫层析法甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒检测阳性的标本核酸载量平均值为(5.09±1.56)×107拷贝/mL，检测阴性的标本核酸载量平均值为(1.11 ±1.38)×106拷贝/mL，差异有统计学意义(t=6.85，P ＜0.0001)。

2.根据病毒核酸载量将151例甲型H1N1流感病毒(2009)PCR核酸检测阳性标本分成≥108、107～、106～、105～ 和 ＜105拷贝/mL 5 组。以甲型H1N1流感病毒(2009)核酸检测结果为标准，胶体金免疫层析法甲型流感病毒抗原检测试剂盒的敏感性分别为 73.3%、51.7%、36.7%、18.8%和16.7%;胶体金免疫层析法甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒的敏感性分别为73.3%、41.4%、26.7%、12.5%和 6.7%，见表 3。2种试剂盒的敏感性与标本的病毒核酸载量均呈正相关(Spearman相关系数分别为0.424，P＜0.01和0.492，P ＜0.01)，且为线性关系(分别为χ2=27.06，P ＜0.01 和 χ2=36.48，P ＜0.01)。

表3 不同病毒核酸载量的胶体金免疫层析法检测结果

四、胶体金免疫层析法的理论敏感性分析

由于胶体金试剂盒要求将标本加入到0.5 mL的抽提液后立即检测，而本研究采用了低温冻存的咽拭子标本，其采集时加入了3 mL的专用标本采集液，相当于将标本的浓度稀释了约6倍。为了评价上述情况对胶体金免疫层析试剂敏感性的影响，我们进一步对病毒载量与敏感性的关系进行Logistic回归分析。假设试剂敏感性为M，病毒拷贝数的对数为L，甲型流感病毒抗原检测试剂盒、甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒的敏感性为 MA、MA+B，则:

根据这个公式，我们可以推算出，2种试剂盒在发病后1～2 d取样，标本的理论敏感性分别为77.3%和 74.6%。

讨 论

流感病毒容易发生变异，其抗原性变异与流感的发生、流行密切相关[1]，在流感爆发流行期早期快速诊断对于疫情防控至关重要，目前流感病毒常用的实验室检测方法包括病毒培养、免疫荧光、核酸检测和血清学检测法等。当甲型H1N1流感病毒(2009)开始在全球范围内流行后，世界卫生组织 (WHO)以及美国疾病预防控制中心(CDC)推荐的实验室检测方法均为RTPCR或实时荧光PCR[3-4]。但这些方法需要特殊仪器设备，操作复杂且耗时较长，难以在医院发热门诊和海关口岸开展现场筛查。胶体金免疫层析法作为一种快速抗原检测技术，操作简便，可在15 min左右得到结果，适合现场检测。

在国内外文献报道中，胶体金免疫层析法快速抗原检测对新型甲型流感病毒的敏感性各不相同。Drexler等[5]发现胶体金免疫层析法快速检测试剂对甲型H1N1流感病毒(2009)的敏感性只有11%，对2007至2008年及2008至2009年间的季节性流感病毒敏感性为37.5%和51.9%。而同种试剂在 Faix等[6]的研究中对甲型 H1N1流感病毒(2009)的敏感性为51%;在Uyeki等[7]的研究中对季节性流感病毒的敏感性只有27%。在国内关于胶体金免疫层析法检测甲型H1N1流感病毒(2009)的文献中，郑海潮等[8]报道的敏感性为35.6%;尤凤兴等[9]报道的敏感性为 44.8%;穆煜等[10]报道的敏感性为 66.7%;程晓东等[11]报道的敏感性为 78.1%;而石汉振等[12]报道的敏感性则高达96.7%。本研究中使用胶体金免疫层析法甲型流感病毒抗原检测试剂盒、甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒检测甲型H1N1流感病毒(2009)，以PCR核酸检测结果为标准，2种试剂盒的敏感性分别为39.1%和31.8%，与PCR检测一致性均较差(Kappa值＜0.4)。一致性检验的结果与张素美等[13]、贾宁等[14]的报道基本相符，说明胶体免疫层析法检测甲型H1N1流感病毒(2009)的敏感性存有一定的局限性。

我们分析导致各胶体金免疫层析试剂敏感性差异的原因，可能与各试剂生产厂家所采用的抗体和载体等原材料不同有关，且采用不同的参比标准得到的敏感性也会不同。比如在魏娟等[15]的报道中，同种胶体金免疫层析试剂与病毒培养相比的敏感性为63.6%，而与RT-PCR相比的敏感性则为73.8%。而本研究的结果提示，采样时间以及体内病毒载量等因素也是影响其敏感性的关键因素。我们对不同病程标本的检测阳性率进行了比较，发现甲型流感病毒抗原检测试剂盒、甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒的阳性率在发病早期1～2 d时分别为66.7%和62.5%，发病后期5～d时分别为27.3%和20.0%;检测阳性率随病程延长而下降，两者呈线性负相关(P＜0.01)。在此基础上，我们进一步对胶体金免疫层析法在不同病毒载量阳性标本中的检测敏感性进行了比较，发现病毒载量≥108拷贝/mL时，2种试剂盒的敏感性均可达73.3%;而＜105拷贝/mL时，2种试剂盒的敏感性分别只有16.7%和6.7%;检测敏感性随着病毒核酸载量的降低而下降，两者间呈线性正相关(P＜0.01)。另外，试剂盒说明书要求采集的鼻咽拭子标本应加入0.5 mL的抽提液后立即检测，而本研究中的鼻咽拭子标本加入了3 mL的专用标本采集液，相当于稀释了6倍左右，可能对敏感性有所影响。因此，我们对检测敏感性进行了Logistic回归分析，推测2种试剂盒在发病早期1～2 d取样时的理论敏感性分别可达77.3%和74.6%，此理论值与国外Lee等[16]的报道基本相符。

本研究结果表明，尽管以胶体金免疫层析试剂盒检测甲型H1N1流感病毒(2009)的敏感性仍有一定的局限性，但是其在发病早期及病毒载量较高时仍有较好的检测效果。流感作为第1个实行全球性监测的传染病，其危害引起人们的广泛关注。当流感病毒发生抗原性变异导致新的病毒株产生时，则会出现局部及至全球性大流行[1]。鉴于胶体金免疫层析法流感病毒抗原检测试剂还同时具备操作简便、需时较短、结果判断容易、不需要特殊仪器设备、处理大量标本更为快速方便等诸多优点，我们认为其可在流感病毒大范围流行时，在医院发热门诊以及机场、海关、学校等现场用于早期诊断，有效帮助快速筛查发病早期的患者和疑似患者。但是鉴于胶体金免疫层析法自身的局限性，其结果只能作为初步参考，最终的确认结果应以PCR结果为准。

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