急性胎兔宫内窘迫模型脑NO、iNOS和T-SOD变化实验研究

林也容 周龙 吴芳芳 李娟 张兰 黄丽玲 陈慧 郁毅刚

急性胎兔宫内窘迫模型脑NO、iNOS和T-SOD变化实验研究

林也容 周龙 吴芳芳 李娟 张兰 黄丽玲 陈慧 郁毅刚

目的 建立孕兔宫内窘迫模型, 探讨胎兔脑一氧化氮(NO)、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)含量变化规律。方法 新西兰大白孕兔30只, 随机分为空白对照组(n=12)、假手术组(n=9)和宫内缺血缺氧组(n=9), 宫内缺血缺氧组建立孕兔开腹子宫动脉结扎胎兔宫内窘迫缺血缺氧模型, 分别开腹取各组胎兔脑匀浆液测定NO、iNOS和T-SOD含量, 进行统计学比较。结果 与空白对照组比较, 假手术组和宫内缺血缺氧组 NO、iNOS的含量显著升高(P＜0.01), T-SOD的含量明显降低(P＜0.01), 差异具有统计学意义。与假手术组相比, 宫内缺血缺氧组NO、iNOS显著升高(P＜0.01),差异具有统计学意义；T-SOD降低不显著(P=0.399)。 结论 通过检测孕兔宫内窘迫模型NO、iNOS和T-SOD显示, 胎兔缺氧应激反应强烈, 手术操作及子宫动脉结扎对脑组织内自由基含量影响显著。

孕兔；子宫动脉结扎；宫内缺血缺氧；一氧化氮；诱生型一氧化氮合酶；超氧化物歧化酶

胎儿窘迫(fetal distress, FD)是围产期新生儿事件最主要病因, 造成死产、新生儿缺血缺氧性脑病( hypoxie-ischemic encephalopathy, HIE),甚至进一步危及母体。缺血缺氧引起的中、重度新生儿脑损伤, 导致脑瘫、癫痫以及发育迟滞等严重的后遗症, 给社会、家庭和个人带来沉重负担。FD造成的新生儿损害是全身系统性的, 根据其病理特点建立科学合理的动物模型, 是深人研究FD乃至HIE发病机制、治疗方案的基础。本研究通过建立胎兔FD模型, 研究HIE新生兔脑早期NO、iNOS和T-SOD。

1 材料与方法

1.1 主要仪器、动物及试剂 30只健康成年新西兰大白兔4周左右孕兔, 普通级。体质量3.2～3.7 kg, 由上海松江松联实验动物场生产, 厦门大学医学院动物中心提供。动物许可证：SCXK(沪)2007-0011。实验动物使用单位许可证编号：SYXK(军)2002-47。动物实验人员资质许可证编号：军动管字第2006E01028。氧自由基试剂盒购自南京建成生物工程研究所。分光光度计(722S, 福建新大陆), 温度湿度计(HTC-1数字温度湿度计, 漳州安德培), 鼠兔解剖台、手术器械若干。

1.2 实验分组 实验分组：实验孕兔饲养3 d, 每日傍晚测体温、脉搏、呼吸1次。至孕32～34 d实验, 剔除异常极值动物, 经统计分析, 个体间无明显差异。编号按随机表分成3组, 空白组12只, 假手术对照组9只, 缺血缺氧脑病组9只。

1.3 实验方法 模型制作：妊娠34 d孕兔以2.5%戊巴比妥钠0.1 ml/100 g进行腹腔麻醉后, 耻区下腹部正中切口打开腹腔, 暴露双侧子宫角, 检查胎盘、子宫及孕兔活力。分离出进入每个胎盘的分支动静脉血管, 用无创性血管夹钳夹此分支血管, 持续20 min, 然后松开血管夹, 恢复血流, 对胎兔进行处死、取脑。假手术组胎兔, 在分离出进人每个胎盘的分支血管后, 不进行钳夹, 20 min后直接处死、取脑。空白组对照组胎兔不做任何处理, 直接处死、取脑。

1.4 观察指标 A014 -1 iNOS分型试剂盒, A012 NO试剂盒(硝酸还原酶法), A001-1 羟胺法SOD试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供, 严格按其说明书操作。

1.5 统计学方法 全部数据应用SPSS 13.0统计软件处理,采用One-Way ANOVA Test统计分析, 方差不齐时非参数法秩和检验Kruskal-Wallis Tset(H检验), 组间均数用Bonferroni法两两比较, 结果以均数±标准差( x-±s)表示, P＜0.05视作差异具有统计学意义 。

2 结果

空白对照组、假手术组和宫内缺血缺氧组3组胎兔脑组织iNOS、NO和T-SOD含量之间比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。宫内缺血缺氧组脑组织NO、iNOS含量较空白和假手术组均明显升高(P＜0.01)；而假手术组上述指标也高于空白对照组(PiNOS＜0.01, PNO=0.07)。与空白对照组比较, 假手术组和宫内缺血缺氧组T-SOD的含量明显降低(P＜0.01), 见表1。

表1 胎兔脑早期iNOS、NO和T-SOD含量

表1 胎兔脑早期iNOS、NO和T-SOD含量

注：a与空白对照组和假手术组比较, P＜0.01；b与空白对照组比较, P＜0.01；c与空白对照组比较, P＜0.01。

分组例数iNOS(U/ml) NO(μmol/L) T-SOD(U/ml) x-±s秩x-±s x-±s秩x-±s x-±s秩x-±s空白对照组1273.99±42.126.40±4.3097.30± 30.608.05±4.88209.17±10.6524.95±3.91假手术组9167.27±66.5216.20±6.19b162.70± 97.2414.45±8.19b184.88±13.2312.70±5.50c宫内缺血缺氧组9290.42±134.3723.90±4.68a287.00±110.9924.00±3.94a167.51±25.568.85±6.86c

3 讨论

胎儿宫内窘迫是指胎儿在子宫内因为缺血缺氧和酸中毒导致危及其健康和生命的综合症, 可致新生儿窒息。窒息可导致新生儿低氧血症和混合性酸中毒, 是围生期胎儿及新生儿死亡的重要原因之一。

新生儿窒息是围生期常见病, 窒息时缺氧导致机体的损害是全身性和多脏器的, 以脑、心脏、肾脏等脏器为主［1］。新生儿各脏器尚处于发育中, 其对HIE及再灌注后的反应与成人并不完全一致。本研究拟以妊娠生理、胎盘发育与人类相似的兔为研究对象, 探寻一种新的新生儿宫内窘迫后脑损伤的动物模型。

缺氧缺血性脑病仍然是围产儿神经损伤的主要原因之一。尽管近年来国内外许多学者对成人缺血性脑损害做了大量的工作, 也取得了较大成就, 但由于胎儿的特殊性, 不能简单地由此推延应用到胎儿上。对胎儿缺氧缺血性脑损害的分子学发病机制仍然知之不多, 尚无理想的防治方法。

新生儿窒息的本质是缺氧, 可反射性引起全身血流的重新分布, 胃肠道、肾脏、皮肤血流减少。张卫生等［2,3］研究显示窒息后肾血液灌注量明显降低, 可能由于窒息缺氧时机体自身保护机制, 为保证脑、心等重要器官的血供, 而非重要生命器官如肾、皮肤等血流收缩引起肾脏的血流灌注不足所致, 而肾脏本身代谢率高, 肾血流量大, 故肾损伤发生率极高。但目前国内外尚无经典模型用于此方面的研究, 因而对其发病机制的探讨受到限制, 也为临床诊治造成制约。

本研究参照Mamoru等［4］的方法建立此模型。新生儿窒息80%～90%发生于产时和宫内, 而此模型通过对近足月兔阻断子宫血管而诱发短期胎盘缺血, 其损伤时间和诱导方式可提供一个与围生期窒息相似的表现。该模型过去一直应用于宫内发育迟缓的研究, 近年来人们开始利用它研究宫内窘迫时肾损伤, 对于脑损伤的研究国内外报道甚少。以往对新生儿窒息后脏器损伤的研究多借助结扎一侧颈总动脉后吸入低水平氧的动物模型, 显然这一模型与新生儿窒息后脏器损伤的发生过程并不一致。本研究模型通过钳夹供应子宫的动脉和血管, 造成胎兔全身HIE, 与人类窒息后的病理生理过程更为相似, 有人利用此模型对脑损伤的研究亦取得满意的结果［5,6］。故此模型是研究宫内窘迫后脑损伤较理想动物模型。

颅脑损伤后早期iNOS、NO和T-SOD含量, 能够反映颅脑损伤后继发性损害的病情［7］。iNOS在正常生理状态下基因不表达, 当受到缺血缺氧的应激因素的刺激后即被激活,进一步NO的生成。高水平的NO参与机体炎症、免疫应答中起细胞毒与细胞抑制作用的病理生理过程, 引起脑组织和细胞损害［8］。T-SOD是存在于生物体内的重要的抗氧化酶系［9］, 参与抗氧化的病理保护过程。

综上所述, 通过检测孕兔宫内窘迫模型兔脑NO、iNOS和T-SOD含量变化, 能够提示胎兔缺氧应激反应的严重程度, 手术操作及子宫动脉结扎对脑组织内自由基含量影响显著。

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Experimental research on the changes of NO iNOS and T-SOD of brain tissue on acute intrauterine hypoxia in pregnant rabbit model

LIN Ye-rong, ZHOU Long, WU Fang-fang, et al.Department of Obstetrics and Gynecology, 175th Hpspital of PLA Dongnan Hospital Affiliated to Xiamen University, Zhangzhou 363000, China

Objective To Study the changes of NO、iNOS and T-SOD in pregnant rabbits brain tissue after build acute intrauterine hypoxia m odel.Methods 30 New Zealand white pregnant rabbits were randomly divided into 3 groups, blank group(n=12), sham operated group(n=9) and intrauterine ischemia hypoxia group(n=9), according to uterine artery ligation and erecting uterine ischemia hypoxia models.The contents of NO, iNOS and T-SOD in pregnant rabbits brain homogenate were measured and compared.Results Compared with the blank group, the contents of NO and iNOS were significantly increased in sham operated group and intrauterine ischemia hypoxia group(P＜0.01), the contents of T-SOD were significantly decreased(P＜0.01).Compared with sham operated group, the contents of NO and iNOS were significantly increased in intrauterine ischemia hypoxia group(P＜0.01), but the contents of T-SOD were not significantly decreased(P=0.399).Conclusion All pregnant rabbits have an s trong stress response, after the operative procedure and uterine artery ligation, they have an significant effect upon the contents of NO, iNOS and T-SOD in pregnant rabbits brain tissue.

Pregnant rabbit； Uterine artery ligation； Intrauterine ischemia hypoxia； NO； iNOS； T-SOD

福建省自然科学基金(项目编号：2007J0302)；全军十一五医学科研基金面上项目(项目编号：06MB152)；福建省科技计划青年人才项目(项目编号：2006F3150)；福建省漳州市科技计划项目(项目编号：Z10071)

363000 漳州,解放军第一七五医院暨厦门大学附属东南医院妇产科(林也容 吴芳芳 李娟 张兰 黄丽玲 陈慧)；神经外科(周龙 郁毅刚)

林也容 E-mail：yu-yg@tom.com