采用大孔吸附树脂D－101初步分离提取TJ430菌株发酵液中的抗生素

黄永春， 刘红梅， 赵 鹏， 张 伟， 陈志永

（农业部环境保护科研监测所，天津 300191）

大孔吸附树脂是当前微生物源天然产物分离技术领域发展最迅速、最活跃的分支之一，目前它已逐渐取代活性炭和氧化铝等吸附剂，在抗生素工业中显示出越来越重要的地位［1］。大孔吸附树脂是一类有机高聚物吸附剂，它具有比表面积较大、交换速度较快、机械强度高、对被提取物污染小、热稳定好等特点［2］。利用大孔树脂对发酵液中抗生素的吸附与解吸附过程对发酵液中目标产物进行分离纯化，已经成为抗生素分离纯化过程中一种几乎必不可少的程序。有文献报道，近年来国内应用大孔吸附树脂进行分离、提取、浓缩、纯化的抗生素涵盖了目前已知抗生素的所有类型［3］。

发酵液中往往成分复杂，既有大量未完全利用的培养基成分，也存在菌株发酵过程中代谢分泌的非分离目标成分，其中许多成分都可被大孔树脂吸附［4－5］。目前发酵液中抗菌活性成分的分离纯化已经成为制约新型农用抗生素研发的重要瓶颈因素之一。合理优化大孔吸附树脂的吸附与解吸附条件，对从发酵液中分离纯化抗生素具有重要意义。

本课题组在前期研究工作中分离到一株土壤稀有放线菌株 并对它的最适发酵条件进行了研究［7］。室内及室外活性试验研究发现，该菌株发酵液对多种重要植物病原真菌及细菌都具有良好抗性，具有较好的开发前景。本研究在前期研究工作基础上，优化了大孔吸附树脂对发酵液的动态吸附与解吸附条件。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

试验用农用抗生素产生菌由本实验室从土壤中分离得到，编号为TJ430，经鉴定为一株卡伍尔链霉菌（Streptomyces cavourensis）。

抗生素活性测定指示菌：总状毛霉（Mucor racemosus Fres.），由本实验室保存。

1.2 培养基

TJ430斜面培养基：葡萄糖1.8%、蛋白胨0.5%、豆粕0.3%、酵母膏0.1%、CaCO30.025%、琼脂2.0%；

TJ430发酵培养基：葡萄糖1.8%、蛋白胨0.5%、豆粕0.3%、酵母膏0.1%、CaCO30.025%；

抗生素生物活性测定培养基：采用土豆培养基（PDA）。

1.3 大孔吸附树脂种类及来源

工业级大孔吸附树脂：AB－8，NAK－9，D－101，D－4020南开大学合成树脂厂。使用前用乙醇浸泡过夜，抽滤，弃去乙醇相，用蒸馏水反复冲洗至没有乙醇味，备用。

1.4 仪器设备

岛津LC－6AD型高效液相色谱仪（HPLC），配二极管阵列检测器（DAD），C18液相色谱柱（250mm×4.6mm×5.0μm）。液相色谱操作条件：以70%甲醇水作流动相，流速为1.2mL／min，检测波长为254nm。

恒温摇床，上海智城分析仪器制造有限公司。

1.5 发酵液的制备

按照谭悠久等报道的方法发酵制备［7］。

1.6 抗生素生物活性测定方法

采用管碟法［8］对发酵液中有效成分进行测定。取5000r／min离心并经0.45μm孔径滤膜过滤的发酵上清液或解吸附液200μL置于牛津杯中，在土豆培养基上以总状毛霉为指示菌，置于恒温培养箱中于25℃培养24h后，用直尺量取抑菌圈直径。

1.7 大孔吸附树脂型号筛选方法

取200mL经5000r／min离心的发酵上清液于500mL玻璃三角瓶中，分别加入50.0g预处理好的不同型号大孔吸附树脂并封口后，置于摇床上以150r／min振荡吸附2h。分别取经吸附后的发酵液按照1.6中所述方法进行生测。与原始发酵液抑菌圈直径比较，观察不同型号大孔吸附树脂对发酵液中有效成分的吸附能力。

1.8 D－101型大孔吸附树脂最佳吸附时间的研究

取200mL经5000r／min离心的发酵上清液于500mL玻璃三角瓶中，加入50.0g经预处理的D－101型大孔吸附树脂，置于摇床上于室温下以150r／min吸附，重复3次，分别于0、30、60、90、120min取发酵上清液生测，确定最佳吸附时间。

1.9 不同浓度丙酮水溶液对有效成分的解吸附能力研究

分别称取50.0g吸附有有效成分的D－101大孔吸附树脂于500mL玻璃三角瓶中，向其中分别加入 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的不同浓度丙酮水溶液200mL，置于摇床上于室温下以150r／min解吸附120min，每个浓度重复3次，取解吸液1.0mL于10mL小玻璃烧杯中于常温下风干，以1.0mL甲醇复溶并经0.45μm滤膜过滤后进液相色谱测定，记录不同浓度解吸液中有效成分的峰面积。

1.10 70%丙酮水溶液最佳解吸附时间的研究

分别称取50.0g吸附有有效成分的D－101大孔吸附树脂于500mL玻璃三角瓶中，向其中加入70%的丙酮水溶液200mL，封口后置于摇床上于室温下以150r／min解吸附，重复3次，分别于0、30、60、90、120min取解吸液上清1.0mL于10mL小玻璃烧杯中于常温下风干，以1.0mL甲醇复溶并经0.45μm滤膜过滤后进液相色谱测定，记录不同解吸时间下的有效成分峰面积。

1.11 70%丙酮水溶液最佳解吸附pH的研究

分别称取50.0g吸附有有效成分的D－101大孔吸附树脂于500mL玻璃三角瓶中，向其中加入200mL浓度为70%的丙酮水解吸液，在pH计监控下分别调节解吸液的pH 为2.0、3.0、4.0、自然（约6.0）、8.0、9.0、10.0，在摇床上于室温下振荡解吸附120min，抽滤，收集解吸液，取经0.45μm滤膜过滤的解吸液1.0mL于10mL小玻璃烧杯中于常温下风干，以1.0mL甲醇复溶并经0.45μm滤膜过滤后进液相色谱测定，记录不同pH条件下解吸液中有效成分的峰面积。

2 结果

2.1 有效成分液相色谱测定条件

试验过程中分别采用乙腈水和甲醇水作为流动相，采用本实验室自行分离纯化的纯度高达98.3%的纯物质作为标准样品对该抗生素有效成分的最佳测定条件进行了研究。结果发现，当采用乙腈水做流动相时，峰形较差而且主峰与前面杂质分离度较低，故试验中采用甲醇水作流动相。经过对甲醇水配比进行优化后发现，采用浓度为70%的甲醇水作流动相，流速为1.2mL／min时有效成分峰形较好，出峰时间约6.3min，而且与前面杂质分离较好，故最终确定采用70%的甲醇水作流动相，日常检测均在该条件下进行。

图1 有效成分液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of the active ingredients

图2 有效成分最大吸收波长Fig.2 The maximum absorption wavelength

采用二极管阵列检测器对有效成分主峰在190～800nm范围内的吸收情况进行扫描，结果发现该成分最大吸收峰在251nm，在实际测定中采用最常用的254nm作为检测波长。

2.2 最适大孔吸附树脂的确定

大孔吸附树脂的极性直接影响到对发酵液中有效成分的吸附特性，因此不同化学结构的生物活性成分最适用的大孔树脂类型均不相同。有报道银杏叶中总黄酮类采用X－5树脂吸附［9］，大豆皂苷采用AB－8树脂吸附［10］。本研究考察了 AB－8，NAK－9，D－101，D－4020共计4种大孔吸附树脂对发酵液中有效成分的吸附效果，动态吸附2h后发酵液生测结果如表1所示。

表1 四种大孔吸附树脂吸附剩余液生测结果1）Table 1 The bioassay results of fermentation broth adsorbed by macroporous resin

由表1可见，原始发酵液活性较强，抑菌圈直径可达到30.0mm 以上；AB－8、NAK－9、D－40203种树脂对发酵液中有效成分有部分吸附能力，但是吸附120min后发酵液中仍能检测到明显的生物活性；D－101型大孔吸附树脂对发酵液中有效成分的吸附能力最强，吸附120min后发酵液中已经检测不到生物活性，因此最终确定D－101型树脂作为最佳吸附树脂。

2.3 最佳吸附时间

分别间隔30min吸取D－101型大孔树脂吸附剩余发酵液生测，以吸附时间为横坐标，抑菌圈直径为纵坐标作图如图3所示。

图3 发酵液活性与吸附时间的关系Fig.3 The relationships between adsorption time and fermentation broth activity

由图3可见，随着吸附时间的延长发酵液活性迅速下降，当达到90min时发酵液已经检测不到活性，为保险起见试验中将吸附时间设定为120min。

2.4 最佳解吸液浓度的确定

试验过程中考察了10%～100%浓度范围内丙酮水溶液对大孔树脂的解吸附能力，以丙酮水浓度为横坐标，以解吸液中有效成分的峰面积为纵坐标作图，如图4所示。

图4 丙酮浓度对解吸能力影响Fig.4 The effects of acetone concentration on desorption ability

由图4可见，当丙酮浓度低于40%时，不能从大孔树脂上将有效成分解吸下来；当丙酮浓度高于40%时有效成分开始被解吸下来；当丙酮浓度达到70%时，解吸液中有效成分含量达到最高，但是继续增加丙酮浓度并未继续提高解吸液中有效成分浓度。因此从节省有机溶剂用量方面考虑最终选择70%丙酮水作为解吸附剂。

2.5 最佳解吸附时间的确定

试验过程中考察了70%丙酮水溶液的最佳解吸附时间。每间隔30min取样进液相色谱对有效成分浓度进行检测，以解吸附时间为横坐标，以有效成分峰面积为纵坐标作图，如图5所示。

图5 解吸液中有效成分随时间变化规律Fig.5 Variation of active ingredients in desorption solution

由图5可见，随着解吸时间的延长，解吸液中有效成分含量逐渐增加，当达到120min以后随着时间延长解吸液中有效成分含量几乎不再变化，因此最终确定以120min作为最佳解吸时间。

2.6 最佳解吸pH的确定

试验过程中考察了70%丙酮水在pH＝2.0～10.0范围内的解吸附能力。用液相色谱对解吸附120min时解吸液中有效成分含量进行测定，结果如图6所示。

图6 pH对解吸能力的影响Fig.6 The effects of pH on desorption ability

由图6可见，当解吸液pH低于2时，70%丙酮水溶液不能对D－101型大孔吸附树脂形成有效解吸附，解吸液中未检测到有效成分存在。当pH升高时70%丙酮水溶液的解吸能力迅速上升，当达到pH＝6.0的中性条件时解吸能力达到最大，继续升高pH解吸液中有效成分含量变化不明显。综合考虑到接近中性条件可省去调节溶液pH的步骤，有利于避免调酸或调碱过程中有效成分降解，最终确定以中性条件作为最佳解吸pH条件。

3 讨论

发酵液中成分复杂，直接将发酵液进高效液相色谱对整个系统尤其对色谱柱损伤较大，因此本研究中采用生物测定与液相色谱测定相结合的方法对有效成分进行跟踪检测。当有效成分被吸附在大孔树脂上以后，对有效成分而言就完成了一次极大的净化过程，去掉了发酵液中大部分杂质。此后，大孔树脂解吸液经风干、甲醇复溶并过滤后再进入高效液相色谱时对色谱系统的影响已经可以控制在可接受范围以内。本试验在解吸附试验中采用了直接进液相色谱检测的手段，不仅提高了分析速度，而且提高了检测方法的灵敏度和准确度，为试验结果提供了可靠的数据支撑。

发酵液中有效成分的分离纯化过程关系到新型农用抗生素研发的成败。大孔树脂的吸附与解吸附过程几乎已经成为抗生素分离纯化的必备手段之一。在该过程中解吸附参数的确定尤其重要，本研究中在探讨pH对解吸附过程影响时发现，酸性条件（pH≤2.0）下70%丙酮水溶液不能对有效成分形成解吸附，该结论对本有效成分的分离纯化过程具有重要指导意义，试验表明在pH＝2.0时本有效成分能够稳定存在（数据未列出），但是大孔树脂上所吸附的大部分有色杂质则可被有效解吸下来，经此步骤可形成一次对有效成分的高效净化。

大孔树脂的吸附与解吸附过程是一次重要的分离纯化过程，但是经过该过程的净化后解吸液中仍含有约二分之一的杂质，要想获得更高纯度的有效成分还需结合其他方法进一步精制。

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