针对fim W基因沙门氏菌的特异性PCR检测

张江英，董立伟，王小舟，朱国强

(扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009）

针对fim W基因沙门氏菌的特异性PCR检测

张江英，董立伟，王小舟，朱国强*

(扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009）

为建立沙门氏菌快速检测方法，本研究根据沙门氏菌Ⅰ型菌毛蛋白调控基因fimW设计一对引物，建立PCR检测方法，并对收集的A群～F群14个血清型40株沙门氏菌和5种12株非沙门氏菌菌株进行PCR扩增。结果显示所有沙门氏菌均扩增出与预期(477 bp）相符的特异性片段，而非沙门氏菌扩增结果均为阴性。另外，以肠炎沙门氏菌50336株DNA为模板，敏感性试验结果显示该方法可以检测出扩增体系中1pg DNA染色体和102cfu的沙门氏菌。表明本研究建立了检测沙门氏菌简洁、敏感、特异的PCR方法。

沙门氏菌；检测；fimW基因；PCR

沙门氏菌(Salmonella）能够引起人和动物多种不同临床表现的沙门氏菌病，在医学、兽医学和公共卫生学中非常重要[1]。传统的沙门氏菌检测方法耗时长，并且操作繁琐，难以应对各部门对沙门氏菌病的实时监控。因此，建立快速、灵敏、特异的沙门氏菌检测方法十分必要。目前沙门氏菌快速检测方法多采用免疫学方法、核酸分子杂交以及PCR等，其中PCR方法越来越被广泛用于沙门氏菌检测。

菌毛是大多数肠杆菌科细菌外膜上的蛋白质附属物[2]。沙门氏菌菌毛类型较多，主要有Ⅰ型～Ⅳ型等，但其分布不同，Ⅱ型菌毛主要分布于鸡白痢、鸡伤寒和都柏林沙门氏菌，Ⅲ型菌毛主要分布于肠炎和鼠伤寒沙门氏菌，Ⅳ型菌毛主要分布于鼠伤寒沙门氏菌，只有Ⅰ型菌毛广泛分布于各类沙门氏菌。沙门氏菌Ⅰ型菌毛蛋白由fimA、fimI、fimC、fimD、fimH、fimF、fimZ、fimY和fimW9个基因编码[3]，研究表明fimZ、fimY和fimW3个基因为主要菌毛亚单位蛋白fimA的调控基因[4]。对Gen-Bank中fimW序列进行比对显示沙门氏菌菌株的fimW同源性很高，而且在其它肠道杆菌如大肠杆菌等基因组中未发现与fimW同源的序列。因此，本实验根据fimW设计一对引物，用以沙门氏菌属的特异性检测。

1 材料和方法

1.1 菌 株 本实验所用菌株见表1。其中鼠伤寒沙门氏菌SL1344、LT2、CT18、SL 3261；丙型副伤寒沙门氏菌 RKS 4594；伤寒沙门氏菌 SARC2、SARC3、SARC4和亚利桑那沙门氏菌SARC6(共9株）为哈尔滨医科大学惠赠；其余菌株均为本实验室保存。

1.2 主要试剂TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA Marker DL2000购自宝生物工程(大连）有限公司；DNA凝胶回收试剂盒购自TaKaRa公司；T4 DNA连接酶购自NEB公司。

1.3 引物的设计与合成 根据GenBank中登录的鼠伤寒沙门氏菌fimW基因核苷酸序列，通过DNAStar软件进行序列同源性分析，在fimW基因可变区两端设计一对引物，由上海基康生物技术有限公司合成。fimW Up：5'-AACAGTCACTTTGAGC ATGGGTT-3'；fimW Lo：5'-GAGTGACTTTGTCTGC TCTTCA-3'。预期扩增片段为477 bp。

1.4 PCR模板的制备 采用煮沸裂解法制备模板[5]。核酸蛋白定量仪测定模板浓度，-20℃保存备用。

1.5 PCR扩增体系与程序 PCR扩增体系(25 μL）：10×PCR Buffer(20 mmol/L MgCl2）2.5 μL，模板2.5 μL，上下游引物各 0.5 μL，dNTPs 1.0 μL，rTaq酶2.5 U，双蒸水补足。

PCR扩增程序：94℃4 min；94℃1 min、50℃1 min、72℃ 1 min，25个循环；72℃ 10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析。

1.6 PCR敏感性试验 以肠炎沙门氏菌50336为参照，煮沸裂解法制备模板，测定DNA含量，并依次做10倍倍比稀释至0～100 ng，PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析；将过夜培养的肠炎沙门氏菌50336以生理盐水倍比稀释，每个梯度取2.5 μL直接进行PCR扩增，同时取2.5 μL涂布LB平板，37℃培养16 h计数，以此判定PCR检测纯菌的敏感性。

2 结 果

2.1 PCR扩增结果 以提取的肠炎沙门氏菌50336 DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增，结果显示，扩增产物约 500 bp(图1），与预期结果(477 bp）相符。

图1 fimW基因片段的PCR扩增Fig.1 Specific amplification ofSalmonella fimWgene fragment by PCR

2.2 PCR特异性试验检测结果 将本实验中所有细菌参照煮沸裂解法制备模板，利用特异性引物进行PCR扩增，结果显示，40株沙门氏菌均出现目的片段，而12株非沙门氏菌均未出现目的片段(表1）。

2.3 PCR敏感性试验检测结果 以肠炎沙门氏菌50336株DNA为模板进行敏感性试验，结果显示仅1 pg的DNA仍能够扩增出清晰的目的片段(图2）。以肠炎沙门氏菌50336菌体直接PCR扩增，结果显示：当体系中含有102cfu的细菌时仍可以扩增出清晰目的片段(图2）。表明该PCR方法具有良好的敏感性。

3 讨 论

PCR技术具有速度快、特异性强、灵敏度高等特点。采用PCR技术检测沙门氏菌，其特异性主要取决于所扩增靶序列是否为沙门氏菌高度保守的特异性片段以及引物的设计[6]。

表1 菌株分类及PCR检测结果Table 1 All strains used in this study and the PCR detection

图2 PCR扩增沙门氏菌的敏感性检测Table 2 The sensitive test of PCR forSalmonella fimWgene

本实验建立的PCR方法具有快速简便，灵敏性、特异性高的特点，为沙门氏菌的临床检测提供了技术保证。本实验对所选的40株沙门氏菌和12株非沙门氏菌进行fimW基因的PCR扩增，能够从中筛选出所有的沙门氏菌，特异性高达100%。而且敏感性试验结果显示，该PCR能够扩增出体系中1 pg和102cfu的肠炎沙门氏菌50336株，敏感性高。为进一步检测该PCR方法的特异性，我们将收集更多的沙门氏菌(包括标准株和各地分离的野生株）和非沙门氏菌进行检测。

[1]鄢志刚，徐锋，王建.食源性沙门氏菌快速检测技术的应用研究[J].上海畜牧兽医通讯，2008，1：19-20.

[2]陈小玲，李永清.沙门氏菌fimY基因的原核表达及禽沙门氏菌抗体检测ELISA研究[J].中国家禽，2012，34(13）：19-20.

[3]Zeiner S A,Dwyer B E,Clegg S.FimA,FimF,and FimH are necessary for assembly of type 1 fimbriae onSalmonella entericaserovarTyphimurium[J].Infect Immun,2012,80(9）:3289-3296.

[4]Saini S,Pearl J A,Rao C V.Role of FimW,FimY,and FimZ in regulating the expression of type I fimbriae inSalmonella entericaserovarTyphimurium[J].Bacteriol,2009,191(9）:3003-3010.

[5]Maclnnes J I,Borr J D,Massoudi M,et al.Analysis of southern OntariaActinobacillus(Haemophilus）pleuropneumoniae isolates by restriction endonuclease fingerprinting[J].Canadian J Vet Res,1990,54(2）:244-250.

[6]伍义行，王建国，王芳.聚合酶链式反应在沙门氏菌检测中的研究进展[J].华南预防医学，1989，1：13-15.

Simple and rapid detection ofSalmonellaby direct PCR amplification of thefimWgene

ZHANG Jiang-ying,DONG Li-wei,WANG Xiao-zhou,ZHU Guo-qiang*
(College of Veterinary Medicine,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China）

In the present study,a specific PCR method for detectingSalmonellaspecies was established with a pair of primers designed to according to thefimWgene,which encoded a protein involved in regulatingSalmonellatypeⅠfimbriae expression.The detection results showed that the 477 bp specific DNA fragments were amplified from all of 40Salmonellastrains of 14 serovars with a detection limit of 1pg genomic DNA or 102cfu in the amplifying system with the template DNA fromS.enteritis50336 strain,but no any amplification from 12 non-Salmonellabacteria strains of 5 species.Therefore,the established method is a simple,sensitive and specific forSalmonelladetection.

Salmonella;detection;fimWgene;PCR

S852.61

A

1008-0589(2013）10-0837-03

10.3969/j.issn.1008-0589.2013.10.15

*Correspondingauthor

2012-06-27

国家自然科学基金(31101833、31101826、31270171）；扬州市农业科技攻关计划项目(yz2011066）

张江英(1986-），女，安徽安庆人，硕士研究生，主要从事病原微生物学研究.

*通信作者：E-mail：yzgqzhu@hotmail.com

(本文编辑：张朝霞）