EphrinA1-Fc对人肾透明细胞癌786-O细胞EphA2和ERK表达影响的研究*

徐金升 白亚玲 张俊霞 崔立文 张慧然 张胜雷

EphrinA1-Fc对人肾透明细胞癌786-O细胞EphA2和ERK表达影响的研究*

徐金升 白亚玲 张俊霞 崔立文 张慧然 张胜雷

目的：探讨EphrinA1-Fc对人肾透明细胞癌786-O细胞系促红细胞生成素产生肝细胞受体A2（EphA2）和细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）磷酸化程度的影响。方法：应用可溶性配体EphrinA1-Fc干预人肾透明细胞癌786-O细胞系，采用Wstern blot方法分析不同时间点细胞内EphA2和ERK1/2的磷酸化程度。结果：EphrinA1-Fc干预5、10、30、60 min后，p-EphA2、p-ERK的相对表达量逐渐增加（F=9.392，P=0.025；F=4.428，P=0.041），p-EphA2、p-ERK在EphrinA1-Fc干预前均未见表达。结论：EphrinA1-Fc抑制肿瘤转移复发的可能机制之一是其促使肾透明细胞癌786-O细胞EphA2磷酸化而导致其降解实现。

EphrinA1-Fc 肾透明细胞癌细胞786-O EphA2 ERK 磷酸化

受体酪氨酸蛋白激酶是外界刺激信息传递至细胞核，转化成细胞效应信号通路的关键组成部分，参与细胞生长、增殖、转化及胚胎发育和肿瘤形成，具有重要生理功能。促红细胞生成素产生肝细胞受体（erythropoietin producing hepatocellular receptor，Eph）家族是一类新发现的酪氨酸蛋白激酶受体（receptor tyrosine kinase，RTK），近年来其在肿瘤发生和发展中所起的作用备受关注［1-2］。EphA2是其中最早被发现的一个成员，正常情况下，EphA2与其配体EphrinA1结合后导致二者均发生酪氨酸磷酸化而产生双向信号转导，通过其下游信号调节细胞正常的生长、发育，同时也促进EphA2受体自身降解。但在肿瘤组织中，因EphA2定位异常，不能与其配体正常结合，导致其无法正常降解而在肿瘤组织中异常堆积，促使肿瘤的转移复发。Nakamura等［3］研究显示用EphA2人工可溶性配体EphrinA1-Fc刺激胃癌细胞系可以导致EphA2蛋白表达降低以及EphA2磷酸化水平增加，并能够抑制肿瘤细胞的生长。但目前有关EphrinA1-Fc对肾癌细胞系影响的研究报道较少，本研究就EphrinA1-Fc对人肾透明细胞癌786-O细胞EphA2和ERK1/2磷酸化的影响进行探讨，以明确其抗肿瘤机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 裸鼠 SPF（无特定病原体）级雌性BALB/c-nu/nu小鼠8只，4～6周龄，体质量16～20 g，购自北京康蓝生物科技有限公司。BALB/c-nu/nu小鼠在河北医科大学第四医院动物实验中心屏障环境中饲养，以备后续实验使用。本动物实验已获河北医科大学第四医院伦理委员会认可。

1.1.2 主要仪器和试剂 EphA2、ERK1、ERK2兔抗人多克隆抗体及p-ERK鼠抗人单克隆抗体均购自Santa Cruz公司（美国），APDH兔抗人多克隆抗体购自上海晶美公司，重组鼠抗人EphrinA1-Fc嵌合体购自SYSTEMS公司（英国），IgG-Fc购自Jackson Immunoresearch Laboratiries Inc公司（美国），鼠抗人磷酸化酪氨酸单克隆抗体购自Cell Signaling公司（英国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人肾透明细胞癌786-O细胞系由上海中科院细胞库提供。人肾透明细胞癌786-O细胞系使用含100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素RPMI 1640培养液，于37℃、5%CO2、湿度饱和的培养箱培养，以0.25%胰蛋白酶消化细胞传代，每1～2天更换培养液1次，取对数生长期细胞随机分为实验组和对照组，分别用EphrinA1-Fc和IgG-Fc进行干预。

1.2.2 裸鼠移植瘤模型建立 收集对数生长期的肾透明细胞癌786-O细胞株，1 000 r/min离心5 min，制成单细胞悬液。调整细胞浓度为3×107/mL。用1 mL空针将细胞悬液注入裸鼠左、右腋皮下，0.2 mL/只，含细胞数6×106个，接种后观察注射部位出现结节时间。待裸鼠生长至接种后8周，出现清楚肿瘤界限，将接种成功的8只裸鼠随机分为2组，4只/组。实验组：肿瘤周围注射EphrinA1-Fc（2 mg/mL），0.1 mL/次，3次/周；对照组：注射IgG-Fc，0.1 mL/次，3次/周。实验于肿瘤细胞接种12周结束，干预治疗时间为4周。4周后取出瘤组织，福尔马林固定、石蜡包埋，以备后续实验。

1.2.3 Wstern blot 将收集的细胞加入细胞裂解液200 μL混匀，冰上静置30 min，4℃，11 000 r/min离心20 min，取其上清即为细胞总蛋白，测定细胞总蛋白的浓度。加入蛋白40 μg/孔，10%SDS-PAGE凝胶电泳，蛋白转移到PVDF膜上。5%脱脂奶粉的TTBS室温封闭1 h，一抗稀释于封闭液中，4℃摇晃过夜，TTBS漂洗3次，二抗稀释于封闭液中，室温摇晃1 h，TTBS漂洗3次。蛋白信号由DAB试剂盒检测。采用美国Kodak公司D凝胶成像分析系统对各区带进行定量分析。

1.2.4 EphA2免疫组织化学判断标准 按照S-P试剂盒说明书进行，EphA2免疫组织化学染色以胞浆或胞膜中出现棕黄色颗粒为阳性。结果由两位有经验的病理医师独立双盲评估，每张切片至少观察200个目的细胞的免疫反应情况，在高倍视野（×400）下观察每个目的细胞的染色强度并进行评分。阴性为0分（未着色），弱阳性为1分（浅黄色），阳性为2分（黄色），强阳性为3分（黄褐色）。计算每张切片的阳性细胞百分数，阳性细胞率（%）=（≥1分细胞数量）/（观察细胞总数）×100%。按文献报道的方法［4-5］计算每张切片的HSCORE分值。HSCORE=（i+1）π，其中i代表细胞染色的阳性强度（阳性强度采用0、1、2、3分表示），π代表阳性细胞的百分数（采用0～100%表示）。HSCORE分值＞100%为高表达，≤100%为低表达。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 EphrinA1-Fc干预后肾透明细胞癌786-O细胞形态学变化

正常条件下培养的人肾透明细胞癌786-O细胞接受可溶性配体EphrinA1-Fc刺激1 min，细胞形态即发生改变，细胞由梭形伸展状态开始回缩；5 min时部分细胞变圆；30 min时90%细胞变圆，与瓶壁结合疏松；40 min时部分细胞重新伸展、粘附于瓶壁；60 min时90%细胞恢复到刺激前状态，对照组细胞形态学未发生明显变化。

2.2 EphrinA1-Fc对人肾透明细胞癌786-O细胞内EphA2和p-EphA2、ERK和p-ERK表达的影响

EphrinA1-Fc干预5、10、30、60 min后，p-EphA2相对表达量（p-EphA2/EphA2比值）在5 min时开始出现，并逐渐增高，30 min时达最高。EphrinA1-Fc干预前未见p-EphA2表达（P＞0.05）。p-ERK的相对表达量（p-ERK与ERK1/2比值）在5 min时开始出现，并逐渐增高，30 min时达最高。EphrinA1-Fc干预前未见p-ERK表达（图1，2）。

2.3 EphrinA1-Fc对裸鼠人肾癌细胞移植瘤体积及移植瘤EphA2表达的影响

EphrinA1-Fc干预治疗4周后，移植瘤体积较对照组明显减小，差异有统计学意义（P＜0.05，图3）。免疫组织化学结果显示：EphA2蛋白阳性表达于胞浆或胞膜，实验组移植瘤组织内EphA2蛋白高表达率明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，图4，表1）。

图1 Western blot检测EphrinA1-Fc干预肾透明细胞癌786-O细胞后胞浆内p-EphA2、EphA2、p-ERK和ERK1/2表达情况Figure 1 Expression of p-EphA2，EphA2，p-ERK，and ERK1/2 in the renal clear cells 786-O stimulated by EphrinA1-Fc（Western blot）

图2 EphrinA1-Fc干预肾透明细胞癌786-O细胞后胞浆内p-EphA2、p-ERK相对表达量Figure 2 Comparison of the expression of p-EphA2，EphA2，p-ERK，and ERK1/2 in the renal clear cells 786-O stimulated by EphrinA1-Fc

图3 EphrinA1-Fc和IgG-Fc干预移植瘤4周前后移植瘤体积的变化Figure 3 Change in the volumes of transplanted tumor in nude mice receiving EphrinA1-Fc and IgG-Fc injection for 4 weeks

图4 EphrinA1-Fc和IgG-Fc干预移植瘤4周后EphA2表达情况（S-P×400）Figure 4 Expression of EphA2 in the transplanted tumor stimulated by EphrinA1-Fc and IgG-Fc for 4 weeks（S-P×400）

表1 EphrinA1-Fc和IgG-Fc对移植瘤EphA2表达影响的比较Table 1 Expression of EphA2 in the transplanted tumor stimulated by EphrinA1-Fc and IgG-Fc

3 讨论

本课题前期研究成果显示：EphA2/EphrinA1在肾癌中高表达，并且随着肾癌恶性程度的增加其表达增高。EphA2/EphrinA1在肿瘤的转移复发过程中起着重要作用［6］。近期研究发现，EphrinA1-Fc单克隆抗体刺激恶性肿瘤细胞能阻止肿瘤细胞在软琼脂上聚集［7-8］。EphrinA1-Fc是EphrinA1的模拟配体，是由鼠源EphrinA1胞外区的多聚肽链连接到人源IgG羟基末端的Fc区域而形成［9］，EphrinA1-Fc可与肿瘤细胞膜上的EphA2受体特异性结合而发挥生物学效应。本研究通过观察EphrinA1-Fc干预肾透明细胞癌786-O细胞后形态学改变，与对照组比较发现EphrinA1-Fc对肿瘤细胞具有一定的抑制作用，其作用特点是快速而短暂。又根据EphrinA1-Fc作用的特点，利用EphrinA1-Fc反复干预裸鼠移植瘤，治疗4周后与对照组比较，治疗组的移植瘤体积明显缩小，进一步验证了EphrinA1-Fc抑制肿瘤的作用。

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路代表了一连串磷酸化级联事件，涉及3种关键激酶，即MAPK激酶的激酶（MAPKKK）、MAPK激酶（MAPKK）、MAPK［10］。在真核细胞中，已经发现细胞外调节蛋白激酶（ERK），JNK/SAPK及p38MAPK三条MAPK信号转导通路。其中JNK和p38MAPK两条通路主要与细胞的应激和凋亡有关；ERK（包括ERK1和ERK2）通路是细胞外信号转导至细胞核的关键，其主要与细胞的增殖和分化有关［11-12］。鉴于此，本研究观察了EphrinA1-Fc对肾癌细胞EphA2和ERK及其磷酸化的影响。本研究发现，EphrinA1-Fc干预后EphA2、ERK1/2在各时间点的表达无明显差别，而磷酸化EphA2、ERK却不同，其磷酸化程度呈时间依赖性，随着时间的延长，磷酸化程度逐渐增强，在30 min时效应达到最大，提示EphrinA1-Fc可促使EphA2磷酸化，也提示其作用时间是快速和短暂的，此种现象与研究观察的细胞形态变化是一致的，同时在裸鼠移植瘤模型上证实了EphrinA1-Fc可降低裸鼠移植瘤EphA2的表达。Yang等［13］研究发现，EphA2配体或抗体的刺激能快速而显著地降低细胞与细胞外基质的粘附，本实验结果与其近似。但本研究还发现EphrinA1-Fc可促使ERK发生磷酸化，ERK的磷酸化通常代表Ras/Raf/MAPK通路的激活，细胞增殖加快，粘附性增强，使癌细胞更容易发生侵袭和转移，与EphrinA1-Fc表现出来的抗肿瘤效应相矛盾，分析原因可能是EphrinA1-Fc降解EphA2而抑制细胞生长，进而反馈性激活细胞内Ras/Raf/MAPK通路而对抗EphrinA1-Fc抑制细胞增殖作用，其具体机制有待于进一步研究。

综上所述，EphrinA1-Fc通过促使肾透明细胞癌786-O细胞EphA2受体发生磷酸化而使其降解加速，下调细胞中总EphA2蛋白，进而抑制肿瘤细胞的生长。EphrinA1-Fc有望成为特异性针对EphA2蛋白的抗肿瘤特效药。

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（2013-03-14收稿）

（2013-06-17修回）

Effect of EphrinA1-Fc on phosphorylation of EphA2 and ERK in 786-O renal carcinoma cells

Jinsheng XU,Yaling BAI,Junxia ZHANG,Liwen CUI,Huiran ZHANG,Shenglei ZHANG

Yaling BAI;E-mail:snbyl@163.com
Department of Nephrology,The Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,China

Objective:To detect the effect of EphrinA1-Fc on the phosphorylation of EphA2 and extracellular signal-regulated kinase(ERK)in 786-O renal carcinoma cells(RCCs).Methods:The soluble ligand EphrinA1-Fc was used to inhibit the 786-O RCCs in vitro.Western blot analysis was used to examine the phosphorylation of EphA2 and ERK1/2 in the 786-O RCCs at different time points.Results:After the intervention with EphrinA1-Fc for 5,10,30,and 60 min,the expression of p-EphA2 increased(F=9.392,P=0.025)as well as that of p-ERK(F=4.428,P=0.041).No p-EphA2 and p-ERK expression was observed in the pre-intervention group.Conclusion:One of the possible mechanisms of the inhibitory effect of EphrinA1-Fc on tumor metastasis and recurrence involves the phosphorylation of EphA2 by EphrinA1-Fc,leading to the degradation of EphA2.

EphrinA1-Fc,786-O renal carcinoma cells,EphA2,ERK,phosphorylation

10.3969/j.issn.1000-8179.20130415

河北医科大学第四医院肾内科（石家庄市050000）

*本文课题受河北省科技计划项目（编号：10276177）资助

白亚玲 snbyl@163.com

This work was supported by the Project of Hebei Natural Science Fund(No.10276177)

（本文编辑：张亻 刡）