结核分枝杆菌特异性效应T 细胞斑点数鉴别儿童活动性结核病与潜伏结核感染的价值

田建岭 刘晓灵 孙 琳 焦伟伟 肖 婧 尹青琴 吴喜蓉 郭雅洁 韩 锐 李勤静申阿东

结核病( TB) 目前仍是全球公共卫生的主要问题［1］。γ干扰素释放试验( IGRAs) 通过结核分枝杆菌特异性抗原( ESAT-6 和CFP-10) 刺激外周血单个核细胞释放的γ 干扰素，明确有无结核分枝杆菌感染，不会与卡介苗接种和其他环境分枝杆菌感染产生交叉反应，特异度优于结核菌素皮试［2，3］。目前有两种商业化的试剂盒用于体外检测γ 干扰素，一种是基于酶联免疫吸附试验( ELISA) 法，检测全血γ干扰素浓度，如QFT-GIT； 另一种是基于酶联免疫斑点( ELISPOT) 方法检测结核分枝杆菌特异性效应T 细胞斑点数( 简称T 细胞斑点数) ，如结核感染T 细胞斑点实验( T.SPOT.TB) ，其敏感度优于ELISA 方法［4］。

IGRAs 检测的结核分枝杆菌特异性效应T 细胞经特异性抗原刺激后释放的γ 干扰素，在活动性TB 与潜伏结核感染( LTBI) 中均有释放，目前认为IGRAs 不能区分活动性TB 与LTBI，但两者是结核分枝杆菌感染的不同阶段。既往对TB 患儿在不同的抗结核治疗阶段应用ELISPOT 进行检测，发现T 细胞斑点数随治疗时间延长有逐渐下降趋势［5，6］，提示T 细胞斑点数的数量与感染的状态有关。本研究应用T.SPOT.TB 对儿童活动性TB 与LTBI 的T 细胞斑点数的分布情况进行分析，试图回答T 细胞斑点数在儿童活动性TB 与LTBI 间是否存在差异，是否可找到适当的斑点数界值以区分儿童活动性TB 与LTBI。

1 方法

1.1 纳入标准 首都医科大学附属北京儿童医院( 我院)结核病病房和门诊诊断为活动性TB 或LTBI 的0 ～18 岁行T.SPOT.TB 检查结果阳性且未经过抗结核治疗的病例。

1.2 排除标准 ①长期使用免疫抑制剂，如糖皮质激素等；②合并有其他重大疾病，如白血病、HIV 感染等。

1.3 伦理和知情同意 本研究经我院伦理委员会批准，行T.SPOT.TB 检查为临床需要，不会对研究对象产生不利影响。

1.4 诊断标准

1.4.1 TB 诊断标准 肺结核诊断参考《儿童肺结核的临床诊断标准和治疗方案( 试行) 》［7］，肺外结核参考《实用小儿结核病学》［8］。其中具有典型的临床症状和影像学证据，同时经病原学或组织病理学证实者，即为确诊病例； 具有典型的临床症状和影像学证据，同时具有活动性TB 接触史、PPD 试验阳性、抗结核治疗有效、排除其他肺部疾病4 项中任意2 项者，即为临床诊断病例。结核性脑膜炎与血行播散型TB 为重症TB［9］，余为非重症TB。

1.4.2 LTBI 的诊断标准 T. SPOT. TB 和( 或) PPD 皮试结果阳性( 除外卡介苗接种反应) ，且无TB 的相关临床表现及X 线胸片无TB 特征的患儿。

1.5 分组考虑 依据本文试图回答的T 细胞斑点数在儿童活动性TB 与LTBI 间是否存在差异，将进入分析的病例分为活动性TB 组和LTBI 组，由于活动性TB 中包含重症TB 和非重症TB，活动性TB 组T 细胞斑点数是否会受到重症TB 和非重症TB 的影响，因此在活动性TB 组中再分为重症TB 亚组和非重症TB 亚组。

1.6 实验操作

1.6.1 PPD 试验 患儿前臂皮内注射0.1 mL( 含5 U 的PPD) ，注射后48 ～72 h 测量皮试硬结大小。记录硬结平均直径=( 横径+ 纵径) /2，反应大小以mm 记录。PPD 试验阳性判断标准依据文献［8］：原发或继发免疫功能低下、营养不良和重症TB 患儿以≥5 mm 为阳性； 其他患儿以≥10 mm为阳性，同时能除外卡介苗接种后的免疫反应。

1.6.2 IGRAs 操作按T 细胞检测试剂盒说明书［4］进行( T.SPOT.TB) ，取外周静脉血2 ～4 mL，室温下放置并于4 h内进行试验，用无菌淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，向微孔培养板4 个孔中分别加入50 μL 细胞培养液( 空白对照) 、ESAT-6( 抗原A) 、CFP-10( 抗原B) 和PHA( 阳性质控对照液) ，每个孔中加入100 μL 细胞终溶液( 含有25 万个活细胞) ，将微孔培养板置于37℃5%的CO2培养中孵育16 ～20 h，应用1 × PBS 洗板，加入二抗置于4℃1 h，显色底物进行显色，使用酶联斑点图像自动分析仪进行斑点计数。

T.SPOT.TB 阳性判断标准： 满足以下任一项，①空白对照孔斑点数为0 ～5 个且( 抗原A 或抗原B 孔斑点数) -( 空白对照孔斑点数) ≥6； ②空白对照孔斑点数为6 ～10且( 抗原A 或抗原B 孔的斑点数) ≥2 ×( 空白对照孔斑点数) 。

阴性判断标准： 阳性质控对照孔结果良好( 斑点数≥20) ，但抗原A 或抗原B 孔斑点数均达不到阳性标准。

T.SPOT.TB 的T 细胞斑点数为分别计算抗原A 和B孔与空白对照孔差值，取最大值； 抗原A 和B 孔T 细胞斑点数为相应抗原孔斑点数与空白对照孔的差值。

1.7 统计学方法 活动性TB 组( 重症和非重症TB 亚组)与LTBI 组T 细胞斑点数用中位数( 范围) 表示，组间斑点数比较采用Mann-Whitney U 秩和检验，组内T 细胞斑点数比较采用Wilcoxon 秩和检验。ROC 曲线分析T. SPOT. TB抗原孔T 细胞斑点数，寻找区分活动性TB 与LTBI 的最佳界值，计算曲线下面积( AUC) 、敏感度和特异度及其95%CI。P ＜0.05 为差异有统计学意义。采用SPSS 17.0软件行数据分析，GraphPad Prism 5.0 用于作垂直散点图。

2 结果

2.1 一般情况 图1 显示，2011 年1 月至2012 年8 月依据本文纳入和排除标准进入分析的活动性TB 和LTBI 病例共140 例。活动性TB 组与LTBI 组病例的基本临床信息如表1 所示，活动性TB 组19 例为病原学确诊病例，余为临床诊断病例。重症TB 亚组27 例，非重症TB 亚组66 例。

图1 病例筛选入组流程图Fig 1 Flow chart of case selection process

表1 研究对象信息( n)Tab 1 Characteristics of pediatric patients studied( n)

图2 显示，活动性TB 组T 细胞斑点数中位数为84(6 ～710) ，显著高于LTBI 组的17(6 ～316) ，P =0.000； 非重症TB 亚组T 细胞斑点数中位数为99( 6 ～710) ，显著高于重症TB 亚组的44(6 ～268) 和LTBI 组的17(3 ～316) ，P分别为0.011 和0.000；重症TB 亚组T 细胞斑点数和LTBI组差异无统计学意义( P=0.084) ，但4 组间T 细胞斑点数有较大范围重叠。抗原A 孔和抗原B 孔T 细胞斑点数中位数在活动性TB 组和LTBI 组差异均有统计学意义，抗原A 孔：46( -1 ～557) vs 13( 0 ～316) ，P =0.000； 抗原B 孔：35( -3 ～710) vs 12(2 ～297) ，P =0.001；抗原A 孔T 细胞斑点数中位数在两组中均高于抗原B 孔，但差异无统计学意义( 活动性TB 组P=0.926，LTBI 组P=0.541) 。

表2 显示，区分活动性TB 和LTBI，T.SPOT.TB、抗原A和抗原B 孔T 细胞斑点数ROC AUC 分别为0.731(95%CI：0.642 ～0.819) ，0.725(95%CI：0.638 ～0.811) 和0.680(95%CI：0.587 ～0.774) ；区分非重症TB 和LTBI，重症TB 和LTBI，重症TB 和非重症TB 的ROC AUC 分别为0.775 (95%CI：0.688 ～0.863) ，0.621( 95%CI： 0.486 ～0.757) ，0.668(95%CI，0.549 ～0.787) 。以T.SPOT.TB 的T 细胞斑点数区分LTBI 与活动性TB 的准确性最佳，T 细胞斑点数界值为43.5，敏感度与特异度分别为69.9%和70.2%；区分非重症TB 和LTBI 的T 细胞斑点数界值为44，敏感度和特异度分别为77.3%和70.2%，区分非重症TB 和重症TB 的T 细胞斑点数界值为44.5，敏感度和特异度分别为77.3%和51.9%。

图2 活动性TB、重症和非重症TB、LTBI 患儿T.SPOT.TB 的T 细胞斑点数比较Fig 2 Dot plots of effector T-cell spots above negative control in children with active TB，severe TB，non-severe TB and LTBI

表2 活动性TB、重症TB、非重症TB 和LTBI 儿童T 细胞斑点数ROC 曲线分析Tab 2 ROC curve analysis of T. SPOT. TB spots among children with active TB，severe and non-severe TB and LTBI

随T 细胞斑点数界值取值的增大，区分LTBI 与活动性TB 的敏感度逐渐降低，特异度、阳性似然比和阴性似然比逐渐升高( 表3) 。

表3 不同T.SPOT.TB 的T 细胞斑点数界值区分儿童活动性TB与LTBI 的敏感度、特异度及似然比Tab 3 Sensitivity，specificity and LR of different cut-off values in differentiating active TB from LTBI

3 讨论

本研究对T.SPOT.TB 的T 细胞斑点数分析显示，活动性TB 组T 细胞斑点数中位数显著高于LTBI 组(84 vs 17) ，其中非重症TB 亚组( 99) 显著高于重症TB 亚组( 44) 和LTBI 组(17) ，提示活动性TB 与LTBI 组T 细胞斑点数的差异主要源于非重症TB。T 细胞斑点数在活动性TB 组明显高于LTBI 组，提示其数量可从一定程度上反映了体内结核分枝杆菌负荷的程度，进一步的ROC 曲线分析显示，T.SPOT.TB 的T 细胞斑点数的AUC( 0.731) 高于抗原A 孔(0.725) 和抗原B 孔(0.680) ，提示区分活动性TB 与LTBI的准确性以T.SPOT.TB 最佳，相应的斑点数界值为43.5，敏感度和特异度分别为69.9%和70.2%。另外，从表3 可见随T 细胞斑点数界值增大，其区分活动性TB 与LTBI 的特异度逐渐升高，界值为185 时的特异度达95.7%，较高的特异度对临床诊断儿童活动性TB 具有一定的指导意义。

Latorre 等［10］应用T. SPOT. TB 的研究显示，T 细胞斑点数在儿童活动性TB(12 例) 与LTBI(61 例) 间无显著性差异，ROC AUC 为0.596，T 细胞斑点数界值为145 对应的敏感度和特异度分别为25%和80%，作者考虑与儿童结核感染通常为近期感染，机体反应程度在活动性TB 和LTBI间相似有关。本研究以T 细胞斑点数界值特异度≥80%作为区分活动性TB 与LTBI 的理想界值时，其敏感度是文献［10］的近2 倍(47.3% vs 25%) ，而T 细胞斑点数界值较低(94.5 vs 145) ，考虑可能与入组人数(73 vs 140) 、活动性TB 和LTBI 人数比例(12/61 vs 93/47) 以及PPD 试验阳性比例的不同有关。成人研究显示T 细胞斑点数在PPD 试验阳性组高于阴性组，将两者合并分析时界值低于仅分析PPD 试验阳性人群［10］。

T 细胞斑点数在成人活动性TB 亦显著高于LTBI( P ＜0.001) ，但也因T 细胞斑点数分布在两人群间有较大范围的重叠，而 不 能 区 分 活 动 性TB 与LTBI［10～12］。Latorre等［10］和Janssens［12］等应用ROC 曲线分析寻找区分活动性TB 和LTBI 的T 细胞斑点数界值，文献［10］( 活动性TB 37例，LTBI 85 例) 显示以抗原A 孔T 细胞斑点数区分活动性TB 与LTBI 最佳( AUC 0.677) ，以T.SPOT.TB 的T 细胞斑点数区分活动性TB 与LTBI 的最佳界值为50，敏感度为70.3%，特异度为56.5%。文献［12］( 活动性TB 57 例，LTBI 127 例) 显示以T.SPOT.TB 的T 细胞斑点数的准确性最佳( AUC 0.805) ，界值为49.5，敏感度和特异度分别为82.8%和74.2%，两研究间结果的不一致可能与入组研究对象人数不同有关。本研究也显示，T.SPOT.TB 的T 细胞斑点数分布在活动性TB(6 ～710) 、重症TB(6 ～268) 、非重症TB(6 ～710) 和LTBI(3 ～316) 间有较大范围重叠，提示不能用T 细胞斑点数的数量区分活动性TB 和LTBI，也不能区分重症和非重症TB，与成人研究结果一致。但菌负荷多的重症TB 亚组T 细胞斑点数比非重症TB 少，考虑与高菌负荷的个体体内抗原特异性T 细胞产生效率较低有关［13］。

本研究入组的研究对象多数在T. SPOT. TB 检测前已行PPD 试验，但间隔时间未超过3 d，因PPD 试验先于T.SPOT.TB 有可能产生复强效应干扰T 细胞斑点计数。成人研究显示PPD 试验对IGRAs 的影响主要出现在PPD 阳性人群［14～18］，PPD 试验后3 d 内查IGRAs 是安全的［15，18］，而皮试后第7 天的γ 干扰素浓度和T 细胞斑点数较皮试当日有明显升高［18］。Richeldi 等［19］对有结核病暴露史的儿童同时应用PPD、QFT-G(70 例) 与QFT-GIT(81 例) 进行筛查，并在8 ～11 周后复查QFT，未发现PPD 试验前后γ 干扰素水平有明显变化，认为不会造成IGRAs 的假阳性反应。

4 结论

儿童活动性TB 尤其是非重症TB 的T 细胞斑点数显著高于LTBI 儿童，T 细胞斑点的数量从一定程度上反映了体内结核分枝杆菌负荷程度；因T 细胞斑点数在活动性TB与LTBI 间有较大范围重叠，且其界值区分两者的敏感度和特异度均较低，故不适用于儿童LTBI 与活动性TB 的鉴别诊断。

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