复合荧光RT-PCR技术检测TBX2和p53在甲状腺癌表达及临床诊断意义

陈辉王云云刘艳

(1.广州军区武汉疗养院，430074；2.华中科技大学同济医学院，430030)

复合荧光RT-PCR技术检测TBX2和p53在甲状腺癌表达及临床诊断意义

陈辉1王云云2刘艳2

(1.广州军区武汉疗养院，430074；2.华中科技大学同济医学院，430030)

目的 探讨TBX 2、p53在正常甲状腺组织、甲状腺癌组织中的表达及临床诊断意义。方法 采用复合荧光RT-P CR技术检测45例甲状腺癌组织和10例正常甲状腺组织中TBX 2、p53基因mRN A的表达。结果 不同病理学类型甲状腺癌TBX 2基因mRN A表达峰高与β-actin基因mRN A表达峰高之比在(1.283 2±0.354 5)～(2.37±0.488 9)，较正常甲状腺明显高(P＜0.01)；不同分化程度甲状腺癌TBX2基因、β-actin基因mRN A表达平均峰高比值较正常甲状腺明显高(P＜0.01)。不同病理学类型甲状腺癌p53基因mRN A表达峰高与β-actin基因mRN A表达峰高之比在(1.196 4±0.326 7)～(2.838 6±0.467 9)，较正常甲状腺明显高(P＜0.01)；不同分化程度甲状腺癌p53基因、β-actin基因mRN A表达平均峰高比值较正常甲状腺明显高(P＜0.01)。结论 联合检测TBX 2和基因mRN A表达可为甲状腺癌的早期诊断、预后判断提供有价值的指标。

甲状腺癌；RT-P CR；mRN A；TBX 2；p53

甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，居头颈部恶性肿瘤之首，也是近年来发病率增长最快的恶性肿瘤之一[1]。T-box蛋白质2(TBX2)是T-BOX基因家族成员之一，属于发育调控相关转录因子基因，其在组织中表达上调，可作为肿瘤标志物。p53基因是人类肿瘤中突变率最高的抑癌基因，其突变型p53能引起细胞增生失控导致肿瘤发生。二者的表达异常均可作为甲状腺癌早期诊断的参考依据之一。

为进一步探讨TBX2和p53异常表达在甲状腺癌临床诊断中的作用，本文采用复合荧光RT-PCR技术，同时检测TBX2和p53基因的表达，并对其相关性进行分析。

1 资料与方法

1.1 资料来源 回顾性收集某医院2011—2012年接受甲状腺癌手术切除甲状腺组织45例，正常甲状腺组织10例，组织均保存于－80℃冰箱中。甲状腺癌及甲状腺正常组织均经病理学诊断确诊。其中甲状腺腺瘤9例，甲状腺乳头状癌(PTC)15例，甲状腺滤泡癌(FTC)12例，甲状腺髓样癌(MTC)8例，甲状腺未分化癌(UTC)1例；按分化程度分化程度高11例，分化程度中12例，分化程度低22例。

1.2 研究方法

1.2.1 RNA提取 取甲状腺组织1 g，用组织匀浆后提取，采用TRIzol快速法提取组织mRNA[2]。

1.2.2 引物设计 应用Primer Premier5引物设计软件设计特异性引物[1，3-4](表1)。

表1 引物设计

1.2.3 一步法RT-PCR扩增法的建立 采用一步法逆转录及PCR反应，反应体系10μL。内含RNA模板4μL，2×反应Buffer 1μL(内含有dNTP)，50 mM Mg2+0.45μL；p53浓度为0.4μmol/L，TBX2浓度为0.3μmol/L；β-actin浓度为0.15μmol/L；RT/Platinum Taq混合酶0.2μL，加Rnase-free的Milli-Q超纯水补足至10μL。PCR扩增条件：50℃×45 min×1 cycle；95℃×2 min×1 cycle，95℃×1 min，58℃×1 min，72℃×2 min，共30 cycles；72℃×10 min。然后4℃保存。

1.2.4 确定mRNA转化的PCR产物 应用ABI 310型DNA测序仪上的Genescan analysis 2.1 version软件，通过与ROX-500标准分子量大小比对，确定TBX2、p53、β-actin基因mRNA转化的PCR产物，并记录测出每个特异性峰的峰高和峰面积。

1.3 统计分析 应用t检验，比较甲状腺癌和正常组织TBX2、p53、β-actin基因mRNA表达的差异与变化[5]。

2 结果

2.1 甲状腺癌组织和正常甲状腺组织TBX2基因mRNA表达峰高的差异 运用多重复合荧光RT-PCR技术，以及ABI 310型DNA测序仪上的Genescan analysis 2.1 version软件对甲状腺癌组织及正常甲状腺组织进行检测，记录甲状腺腺瘤、甲状腺乳头状癌、甲状腺滤泡癌、甲状腺髓样癌、甲状腺未分化癌、正常甲状腺组织进行TBX2基因mRNA表达峰高与β-actin基因mRNA表达峰高之比(表2)。与正常甲状腺组织相比，不同组织分类甲状腺癌组织TBX2基因、β-actin基因mRNA表达峰高比值差异有显著性。

不同分化程度甲状腺癌TBX2基因、β-actin基因mRNA表达平均峰高比值(表3)与正常甲状腺组织相比，不同病理分化程度甲状腺癌组织TBX2基因、β-actin基因mRNA表达峰高比值差异有显著性。

2.2 甲状腺癌组织和正常甲状腺组织p53基因mRNA表达峰高的差异 运用多重复合荧光RT-PCR技术，以及ABI 310型DNA测序仪上的Genescan analysis 2.1 version软件对甲状腺癌组织及正常甲状腺组织进行检测，记录甲状腺腺瘤、甲状腺乳头状癌、甲状腺滤泡癌、甲状腺髓样癌、甲状腺未分化癌、正常甲状腺组织进行p53基因mRNA表达峰高与β-actin基因mRNA表达峰高之比(表4)。与正常甲状腺组织相比，不同组织分类甲状腺癌组织p53基因、β-actin基因mRNA表达峰高比值差异有显著性。

不同分化程度甲状腺癌p53基因、β-actin基因mRNA表达平均峰高比值结果(表5)与正常甲状腺组织相比，不同病理分化程度甲状腺癌组织p53基因、β-actin基因mRNA表达峰高比值差异有显著性。

表2 甲状腺癌组织TBX2基因、β-actin基因mRNA表达平均峰高比值

表3 不同分化程度甲状腺癌TBX2基因、β-actin基因mRNA表达平均峰高比值

表4 甲状腺癌组织p53基因、β-actin基因mRNA表达平均峰高比值

表5 不同分化程度甲状腺癌p53基因、β-actin基因m RNA表达平均峰高比值

3 讨论

TBX2基因位于17号染色体长臂2区3带(17q23)，是T-BOX基因家族成员之一，属于发育调控相关转录因子基因，通过其特有的TBOX区域参与多种生物的发育调控，其编码蛋白TBX2主要通过功能域发挥转录抑制作用。研究发现，TBX2在乳腺癌、胰腺癌等多种肿瘤中高表达，并且与细胞恶性转化、肿瘤细胞增生以及细胞凋亡等有关，促进肿瘤发生、发展[6]。本研究发现，TBX2 mRNA在甲状腺腺瘤、甲状腺乳头状癌、甲状腺滤泡癌、甲状腺髓样癌、甲状腺未分化癌组织中表达的阳性率分别为1.196 4±0.326 7、1.587 9±0.378 7、2.373 2±0.357 4、2.564 7±0.486 9、2.838 6±0.467 9，与正常甲状腺组织相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。在不同分化程度的甲状腺癌组织中，与正常甲状腺组织相比较，差异有高度统计学意义(P＜0.01)，提示TBX2 mRNA在甲状腺癌组织中的表达有一定的特异性，且与甲状腺癌组织的分化程度及组织学分型有关：甲状腺癌组织分化程度越低，恶性程度越高，TBX2 mRNA表达越强。同样，不同分化程度的甲状腺癌组织，与乳头状癌、滤泡癌及髓样癌组织相比较，TBX2表达差异也有显著性，上述结果提示TBX2参与了甲状腺癌的发生发展过程，但其具体作用机制有待进一步研究。

p53基因是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因。该基因定位于人类染色体17q13.1，全长约20 kb，编码一个分子量为53 KDa的磷酸化蛋白。野生型p53蛋白可通过修复损伤的DNA等抑制肿瘤的生长，突变型则诱发机体免疫机制，产生针对p53的免疫抑制，逃避免疫监视，促进肿瘤的生长。人类许多肿瘤中均有不同程度的p53基因突变，在乳腺癌、肺癌、大肠癌、胃癌等肿瘤中突变型p53通常高水平表达[7]。本研究发现p53在正常甲状腺组织未见表达，而在不同组织类型、不同分化的甲状腺癌组织均有表达，且低分化程度越低，甲状腺癌组织中的p53表达越高；不同组织类型中，也表现出一定的差异性，甲状腺髓样癌组织中p53表达高于甲状腺滤泡癌及乳头状癌组织，差异有显著性。提示p53同样也参与了甲状腺癌的发生发展过程，其表达与甲状腺癌分化差、恶性程度高、预后差有密切关联，可将其作为临床诊断、治疗的观察指标之一。对于TBX2、p53在参与了甲状腺癌的发生、发展中的机制，推测认为：有一定的协同作用，TBX2、p53在甲状腺癌组织中高表达可能是甲状腺癌恶性程度高、增生迅速的原因之一，具体作用机制有待进一步研究。

在检测手段方面，本研究应用荧光标记及多重半定量RT-PCR技术研究TBX2、p53基因表达，选择的TBX2、p53基因产物长度分别为211 bp、194 bp相差不大，产物间可能重叠，可在TBX2、p53两基因正链的5’端分别挂上6-FAM(兰色标记)、HEX(绿色标记)；由于管家基因β-actin产物为353 bp，与TBX2、p53两基因表达产物片段长度差异较大。因此，在β-actin基因的正链的5’端分别挂上6-FAM(兰色标记)。将TBX2、p53基因及管家基因β-actin基因放在同一EP管中进行同时、同步RT-PCR扩增，其RT-PCR扩增片段长度相近的产物可以通过片段峰的颜色加以区分。所以，应用荧光标记可以实现多重RT-PCR。

对产物的定量分析，常规RT-PCR半定量研究多常用琼脂糖凝胶电泳、图像扫描分析技术，对RT-PCR产物进行灰度间比较，其分析结果与电泳、摄影技术密切相关，有时甚至可影响科研结果。荧光标记的PCR产物可以准确测定各特异性基因的荧光峰高、峰面积，对各基因表达产物进行定量分析[8]。在进行RT-PCR半定量研究方面，荧光标记、多重复合RT-PCR、毛细管电泳及激光扫描技术有着巨大的优势和应用前景。

[1]宋晓环，王晓林，孙冬梅，等.TBX2在甲状腺癌组织中的表达及其临床意义[J].中国免疫学杂志，2012，28(9)：840-842.

[2]黄代新，吴梅筠，张林，等.大鼠液压冲击脑损伤bFGF及其受体FGFR1 mRNA表达[J].中国法医学杂志，2003，18(3)：131-134.

[3]吴新刚，彭姝彬，闾四平，等.p53对乳腺癌耐药蛋白基因的转录调控[J].中国生物化学与分子生物学报，2012，28(2)：152-157.

[4]SuperScriptⅢFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR[OL].http：//tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/superscript-Ⅲfirststrand_pps.pdf.

[5]贺佳，尹平.医学统计学[M].北京：高等教育出版社，2012：85-101.

[6]Teng H，Parker MI，Prince S.Functional characterization of cis-acting elements involved in basal transcription of the human Tbx2 gene：a new insight into the role of Sp1 in transcriptional regulation[J].Gene，2008，423(1)：8-13.

[7]Kitamura A，Yashima K，Okamoto E，et al.Reduced Fhit expression occurs in the early stage of esophageal tumorigenesis：no correlation with p53 expression and apoptosis[J].Oncology，2001，61(3)：205-211.

[8]Savory J，Rao JK，Huang Y，et al.Age-related hippocampal changes in Bcl-2：Bax ratio，oxidative stress，redox-activeiron and apoptosis associated with aluminum-induced neurodegeneration：increased susceptibility with aging[J].Neurotoxicology，1999，20(5)：805-817.

Objective To explore the expression and clinical significance of TBX2 and p53 in normal thyroid tissue and thyroid cancer.Methods Multiplex fluorescent RT-PCR was adopted to detect the expression of gene mRNA in TBX2 and p53 in 45 cases w ith thyroid cancer tissue and 10 cases with normal thyroid tissue.Results The ratio of TBX2 mRNA expression peak height toβ-actin mRNA expression peak height in different pathologic types of thyroid cancer ranged from(1.283 2±0.354 5)to(2.37±0.488 9)，and it was significantly higher than normal thyroid(P＜0.01)；the average mRNA expression peak height of TBX2 gene and β-actin gene in different degree of thyroid cancer was significantly higher than normal thyroid(P＜0.01).The ratio of p53 mRNA expression peak height toβ-actin mRNA expression peak height in different pathologic types of thyroid cancer ranged from(1.196 4±0.326 7)to(2.838 6±0.467 9)，and itwas significantly higher than normal thyroid(P＜0.01)；the average mRNA expression peak height of p53 gene and β-actin gene in different degree of thyroid cancer was significantly higher than normal thyroid(P＜0.01).Conclusion Joint detection of the expression of gene mRNA in TBX2 and p53 can provide valuable indicators for early diagnosis and prognosis of thyroid cancer.

Thyroid cancer；RT-PCR；mRNA；TBX2；p53

1005-619X(2013)09-0777-03

刘艳

2013-07-05)