玉米花粉黄酮对模拟空间辐照小鼠防护作用的研究

张 浩，卢卫红 ，张宸阁，李泳财

(1.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江哈尔滨150090;2.国家知识产权局专利局专利审查协作广东中心，广东广州510000;3.中粮集团有限公司，北京100020)

随着科学技术的不断发展，人体接触空间电离辐射的机会不断增加。电离辐射线既可以直接攻击生物体内各种生物大分子，从而直接杀伤细胞造成急性辐射损伤，又可以间接激发体内水分子，从而产生大量具有强氧化性的活泼自由基造成危害［1］。无论是何种损伤，均可导致机体产生免疫功能紊乱［2］，长期或大量的空间电离辐射还会引起机体的免疫功能障碍，轻者导致免疫功能长期低下，重者常因合并全身严重感染而死亡［3］。同时电离辐射线还能攻击造血系统，导致贫血、出血等并发症［4］。天然产物中的防辐射活性成分(包括黄酮类、多酚类、多糖类等)，能对电离辐射产生有效地防护作用［5］，越来越受到人们的关注。玉米花粉是我国产量最多的蜂花粉，其具有抗氧化、抗衰老、增强免疫等医疗保健功能［6］，黄酮类化合物是玉米花粉中最主要的天然活性成分，其在玉米花粉的保健功效中发挥着重要作用。本研究探讨了玉米花粉黄酮类化合物对模拟空间辐照所致哺乳动物损伤的防护作用，为进一步开发利用玉米花粉提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米花粉 采集自吉林省蛟河市昌云蜜蜂园;昆明种小鼠 50只，6～10周龄，体重18～22g，均为雄性，由哈尔滨医科大学第二附属医院实验动物中心提供;SOD、GSH-Px、MDA及考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒 购自南京建成生物工程研究所;AB-8大孔树脂 购自安徽三星树脂科技公司;芦丁片 购自临汾宝珠制药有限公司。

CLINAC21 EX医用电子直线加速器 VARIAN公司，哈尔滨医科大学第四医院提供;KQ5200DB型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;FD-18型真空冷冻 上海田枫实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 玉米花粉黄酮提取物的制备 玉米花粉干燥粉末用20倍70%乙醇于45℃水浴下超声辅助提取2h，过滤，取滤液，滤渣再重复提取2次，弃滤渣，合并3次提取的滤液，40℃减压旋转蒸发至膏状，真空冷冻干燥，得到黄酮粗提取物。

黄酮粗提物经甲醇复溶除杂，以适量蒸馏水加温溶解，采用湿法上样进行AB-8大孔树脂柱分离纯化，分别以4倍柱体积蒸馏水、20%、40%、60%、80%和95%乙醇6个梯度的洗脱剂进行洗脱，收集得到的各梯度洗脱液减压旋转蒸发浓缩，真空冷冻干燥，得到6种玉米花粉黄酮提取物。以体外抗氧化实验结果为依据［7］，选取40%、95%乙醇洗脱组分进行体内免疫系统辐射防护分析，两组份分别命名为FMP-1及FMP-2。

1.2.2 动物实验模型建立及血清、组织匀浆的制备

将小鼠随机分为FMP-1给药组、FMP-2给药组、芦丁阳性组、空白对照组、辐照对照组，每组10只。对FMP-1、FMP-2组、芦丁组小鼠分别进行对应剂量药品灌胃，各组灌胃剂量依次为78、54、78mg/kg/d，空白对照组、辐照对照组以10mL/kg/d剂量灌服蒸馏水。每天灌胃1次，连续灌胃21d，第21d灌胃后，除空白对照组外各组均通过医用电子直线加速器进行4.0Gy剂量模拟空间辐照，剂量率为1.00Gy/min，照射野为50cm×50cm，皮源距为100cm，辐照24h后采用眼球取血法采集血液，颈椎脱臼法处死小鼠。

血液样品收集于EDTA-Na2采血管中，静置放入4℃冰箱中冷藏12h，5000r/min低温离心10min，取上清于冻存管中冷藏备用。

处死之后，立即取出小鼠肝脏、脾脏组织，在0.86%(w/v)预冷的生理盐水中清洗净血污，滤纸吸去多余水分，称重。取适量组织置于研钵中，注入少许液氮快速研磨，待组织充分匀浆化后向研钵中加入一定体积0.86%预冷生理盐水，充分混合后转移至离心管，补充生理盐水至加入生理盐水的总体积为肝脏自身重量的9倍，制备成10%的肝组织匀浆。利用离心机以4000r/min的转速离心10min，弃沉淀取上清备用。

1.2.3 肝脾组织匀浆蛋白含量的测定 肝脏、脾脏组织匀浆蛋白含量通过考马斯亮蓝试剂盒测定。

1.2.4 肝脾指数测定 肝(脾)指数=1000×肝(脾)重/体重。

1.2.5 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定 采用南京建成生物工程研究所研制的SOD测定试剂盒进行SOD活力的测定。

1.2.6 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性测定

采用南京建成生物工程研究所研制的GSH-Px测定试剂盒进行GSH-Px活力的测定。

1.2.7 脂质过氧化物(MDA)含量测定 采用南京建成生物工程研究所研制的MDA测定试剂盒进行MDA含量的测定。

1.2.8 统计分析 数据采用SPSS14.0软件进行统计学处理和方差分析。

2 结果与讨论

2.1 玉米花粉黄酮提取物对辐射小鼠肝脾指数的影响

肝脾指数作为典型的脏器指数，可在一定程度上反应机体受损情况［8］，且脾脏作为人体最大的免疫器官，其指数变化能直观显著的反应机体免疫系统状况。各组肝脾指数情况如表1所示。

表1 各组肝脾指数统计表(±s)Table 1The tables of liver and spleen index(±s)

表1 各组肝脾指数统计表(±s)Table 1The tables of liver and spleen index(±s)

注:Δp＜0.05，ΔΔp＜0.01 与空白对照组比较;*p＜0.05，＊＊p＜0.01与辐照对照组比较。表2～表4同。

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由表1可见，同空白对照组相比，辐照对照组肝脾指数均有所下降，且脾指数呈现极显著性下降(p＜0.01)，说明模拟空间辐照对小鼠肝脏造成了一定损伤，且能引起小鼠脾脏不可逆转的严重萎缩，同时，此结果从侧面说明以脾脏为首的免疫器官极易受到辐照射线的伤害。

同辐照对照组相比，芦丁阳性对照组、FMP-1、FMP-2给药组肝脾指数均有所上升，说明玉米花粉黄酮提取物能有效减轻辐射对小鼠肝脏和脾脏的伤害。同时，与辐照对照组相比，FMP-1给药组肝脾指数均表现出显著性差异(p＜0.05)，且同芦丁阳性对照组相比也有明显提高，说明玉米花粉黄酮40%乙醇洗脱物对辐照小鼠肝脾损伤防护作用更佳，且相同剂量情况下其防护效果优于市售芦丁片制剂。

表2 玉米花粉黄酮提取物对辐射小鼠SOD活力的影响(±s)Table 2Effect of corn pollen flavonoids on SOD activity of irradiated mice(±s)

表2 玉米花粉黄酮提取物对辐射小鼠SOD活力的影响(±s)Table 2Effect of corn pollen flavonoids on SOD activity of irradiated mice(±s)

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表3 玉米花粉黄酮提取物对辐射小鼠GSH-Px活力的影响(±s)Table 3Effect of corn pollen flavonoids on GSH-Px activity of irradiated mice(±s)

表3 玉米花粉黄酮提取物对辐射小鼠GSH-Px活力的影响(±s)Table 3Effect of corn pollen flavonoids on GSH-Px activity of irradiated mice(±s)

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2.2 玉米花粉黄酮提取物对辐射小鼠SOD活力的影响

超氧化物歧化酶(SOD)可催化超氧阴离子发生歧化反应，是清除超氧阴离子自由基的特异性抗氧化酶，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，具有保护细胞、调节机体H2O2浓度的生理功能［9］。各组小鼠SOD活力情况如表2所示。

由表2可见，同空白对照组相比，辐照对照组各组织中SOD活力显著下降(p＜0.05)，尤其血清中SOD活力显示极显著性差异(p＜0.01)，说明模拟空间辐照对小鼠组织造成了较大的危害，同时说明，同肝脾组织相比，血液系统更易受到辐射射线的伤害。

同辐照对照组相比，芦丁阳性对照组、FMP-1、FMP-2给药组血清、肝脏、脾脏中SOD活力均有所提高，说明玉米花粉黄酮提取物能较好的保护机体中的超氧化物歧化酶。其中，FMP-1及FMP-2组血清、肝脏、脾脏SOD活力均显著高于辐照对照组(p＜0.05)，同时，同芦丁阳性对照组相比，FMP-1、FMP-2组血清、肝脏、脾脏SOD活力也有所提高。结果说明:玉米花粉黄酮40%及95%乙醇洗脱物均对辐照小鼠机体内超氧化物歧化酶具有显著的保护作用，相同剂量情况下其防护效果优于市售芦丁片制剂。

2.3 玉米花粉黄酮提取物对辐射小鼠GSH－Px活力的影响

谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是机体内广泛存在的一种重要的催化H2O2分解的酶，它特异的催化GSH对H2O2的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用，机体内的GSH-Px具有清除有机氢过氧化物及替代过氧化氢酶清除H2O2的生物学意义［10］。各组小鼠 GSH-Px活力情况如表3所示。

由表3可见，空间模拟辐照对小鼠肝脏中GSH-Px活力影响不大，对脾脏中GSH-Px影响较为显著(p＜0.05)，对血清的影响极为显著(p＜0.01)，说明模拟空间辐照对小鼠脾脏及血液系统造成了较大的危害，同时，此结论与 Wright E G，Enikö Noémi Bogdándi等研究结果相符［11-12］，说明血液系统及免疫系统是机体辐射最敏感系统。

同辐照对照组相比，芦丁阳性对照组、FMP-1、FMP-2给药组血清、肝脏、脾脏中GSH-Px活力均有所提高，说明玉米花粉黄酮提取物能较好的保护机体中的谷胱甘肽过氧化物酶活性。FMP-1血清及FMP-1、FMP-2组脾脏中GSH-Px活力均显著高于辐照对照组(p＜0.05);且与辐照对照组相比，FMP-1给药组肝脏、FMP-2给药组血清中GSH-Px活力均表现出极显著性差异(p＜0.01);同时同芦丁阳性对照组相比，FMP-1、FMP-2组血清、脾脏GSH-Px活力也有所提高。结果说明:玉米花粉黄酮40%及95%乙醇洗脱物均对辐照小鼠机体内谷胱甘肽过氧化物酶具有显著的保护作用，相同剂量情况下其防护效果优于市售芦丁片制剂。

2.4 玉米花粉黄酮提取物对辐射小鼠MDA含量的影响

机体中的自由基能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化作用，产生如醛基(丙二醛MDA)、酮基、氢过氧基等脂质过氧化物，从而造成细胞损伤。因而机体MDA水平的高低常可以反映机体脂质过氧化的程度，从而间接地反应出细胞损伤的程度［13］。各组小鼠MDA含量情况如表4所示。

由表4可见，空间模拟辐照能显著促进小鼠肝脾细胞脂质过氧化反应(p＜0.05)，提高其组织中MDA含量，且对小鼠血液系统能造成极显著性性损伤(p＜0.01)，说明模拟空间辐照对小鼠血液及肝脾组织中的脂质过氧化反应具有促进作用，能显著性的损伤小鼠各组织生物膜，同时，也进一步说明同肝脾组织相比，血液系统更易受到辐射射线的伤害。

表4 玉米花粉黄酮提取物对辐射小鼠MDA含量的影响(±s)Table 4Effect of corn pollen flavonoids on MDA level of irradiated mice(±s)

表4 玉米花粉黄酮提取物对辐射小鼠MDA含量的影响(±s)Table 4Effect of corn pollen flavonoids on MDA level of irradiated mice(±s)

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同辐照对照组相比，芦丁阳性对照组、FMP-1、FMP-2对照组血清、肝脏、脾脏中MDA含量均有所降低，说明玉米花粉黄酮提取物能较好的抑制机体的脂质过氧化反应，对小鼠机体起到一定的保护作用。FMP-1给药组血清、肝脏、脾脏中MDA含量均显著低于辐照对照组(p＜0.05);FMP-2给药组肝脏、脾脏中MDA含量均显著低于辐照对照组(p＜0.05)，且脾脏中 MDA含量差异性极为显著(p＜0.01);同时，同芦丁阳性对照组相比，FMP-1、FMP-2组肝脏、脾脏MDA含量均有所下降。结果说明玉米花粉黄酮40%及95%乙醇洗脱物均能有效抑制辐照小鼠机体脂质过氧化反应，且相同剂量情况下其抑制效果优于市售芦丁片制剂。

3 结论

空间电离辐射可对生物体造成一系列严重的危害，如引起分子化学键断裂，导致组织细胞变性、坏死等。玉米花粉中富含的的黄酮类化合物具有较好的辐射防护作用，能显著提高机体肝脾指数，同时对机体血清及肝脾中抗氧化物酶类(如SOD、GSH-Px等)也具有较好的保护作用，且对机体组织中的脂质过氧化反应也具有一定的抑制作用。结合前人研究，推测玉米花粉中黄酮类化合物对空间电离辐射的防护作用主要表现在血液及免疫系统［14］，其防护效果优于相同剂量情况下的市售芦丁片制剂，即说明玉米花粉黄酮是一类前景广阔的天然辐射防护剂。

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