在线固相萃取——高效液相色谱法检测人血清中氯氮平浓度

张文英，郭莉萍，沈广虎

(1 天津市安定医院，天津 300222;2 戴安中国有限公司)

目前在国内，氯氮平已广泛应用于非典型抗精神病的治疗，其镇静作用强，具有强大的抗精神病效应，对精神病阳性和阴性症状均有良好的疗效，且较少引起锥体外系反应［1］。所以对患者服用氯氮平后体内的血药浓度的监测并建立有效快速的血清氯氮平的检测方法具有现实意义。目前检测血清中氯氮平的常规方法是先将血清进行离线预处理，再进行色谱检测分析，血清的前处理方法非常繁琐，且属于有毒作业，同时离线前处理增加了人为干扰因素，影响结果的准确性。为此我们建立一种在线固相萃取(SPE)前处理方法检测血清中的氯氮平，探讨其准确性和合理性。

1 材料与方法

1.1 材料 Dionex Ultimate 3000系列(Thermo Fisher);脱气机:SRD-3600(PN:5035.9230);泵:DPG-3600SD(PN:5040.0061);自动进样器:WPS-3000SL(PN:5822.0020);柱温箱:TCC-3200(PN:5722.0035);检 测 器:DAD-3600(RS)(PN:5082.0020);色谱软件:Chromeleon Chromatography Data System。氯氮平对照品(湖南洞庭制药提供，批号20081101 纯度 99.9%)，色谱纯甲醇(Sigma，批号 MKBH8418V)，色 谱 纯 乙 腈 (Sigma，批 号WXBB0245V)，醋酸铵(分析纯天津赢达试剂，批号2012914)，超纯水。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 分析柱:Acclaim 120 C18，4.6*250 mm，5 μm(PN:059149:SN:004806);SPE 柱:Capcell MF Ph-1，4.0 ×10(资生堂，12416 guard cartridge);流动相:H2O(100 mM NH4Ac)、乙腈;柱温:30℃;进样量:100 μL;流速:1 mL/min;检测波长:254 nm。

1.2.2 梯度条件 见表1。

1.2.3 氯氮平储备液及工作液的配制 精确称取50 mg氯氮平对照品溶于50 mL甲醇中制成1 mg/mL的储备液，用甲醇将储备液分别稀释成浓度为1～80 μg/mL的工作液。

1.3.4 样本预处理 将标准血清或患者血清10000 r/min离心10 min，取上清直接上机进样。

表1 SPE柱及分析柱梯度条件

2 结果

2.1 专属性实验 在本实验条件下，不同浓度血清氯氮平对照品的色谱图见图1。由图1可知，标准品氯氮平的色谱峰能完全分离，没有明显的内生杂质峰干扰，可见本方法具有较高的专属性;氯氮平的保留时间为10.783 min。

2.2 标准曲线的制备 将不同浓度的工作液分别加入空白血清中制成浓度为 20、50、100、200、400、800、1600 ng/mL的标准血清样本，作为外标液。将外标液10000 r/min离心10 min取上清上机进行检测，以浓度为横坐标X，以峰面积为纵坐标Y绘制标准曲线，Y=0.0042X，r=0.9997，n=7。最低检出限1.5 ng/mL(S/N=3)。见图 2。

图1 不同浓度氯氮平标准血清色谱图

图2 不同浓度的标准血清制成的标准曲线

2.3 精密度实验 取氯氮平低、中、高浓度(50、200、800 ng/mL)含药血清样本，重复检测5次为1批次，再重复测定4批次，色谱分析所得结果经统计学分析计算其批内和批间的精密度见表2。

2.4 回收率 取氯氮平低、中、高浓度(50、200、800 ng/mL)含药血清样本，1 d内重复检测5次，色谱分析所得结果经统计学分析，得到回收率和回收RSD见表3。

表2 在线前处理法测定氯氮平批内批间精密度(n=5)

表3 在线前处理法测定氯氮平的方法回收率(%)

3 讨论

目前氯氮平作为精神科的常用药物已广泛应用于临床。临床上对氯氮平的检测均采用254 nm紫外吸收波长［2］，故本试验亦采用254 nm波长检测。传统血清药物浓度测定方法均需对待测样本进行离线预处理。传统预处理方法主要包括去蛋白法、液液萃取法、固相萃取法。有研究显示，相比前两种预处理方法，固相萃取法操作更简单、用时少，通过比较同一血浆提取后的含量测定色谱图［3］，可见经固相萃取的样本杂质明显减少，因此可减轻对色谱柱的影响，延长其使用寿命［4，5］。但离线预处理过程中会造成提取率不稳定，而且操作繁琐，增加了人为干扰因素，且有机溶剂对工作人员造成伤害。

本研究采用在线SPE样本预处理，该方法自动化程度高，且避免了人为干扰因素，批内批间RSD均＜2%。在许多文献［2］中显示，采用离线预处理方法检测氯氮平其批内批间RSD为5%～7%，甚至接近10%，在线前处理分析所得结果经统计学处理，其精密度及回收率均符合生物样品分析要求，且其精密度有很大提高［5］。总之，该方法操作简便、快速、精确，可大批量检测临床样本，满足临床药物浓度监测需要。

［1］陈新谦.新编药物学［M］.16版.北京:人民卫生出版社，2007:272.

［2］刘伟忠，陈清霞，黄伟侨，等.高效液相色谱法同时测定人血浆中氯氮平与氟西汀的浓度［J］.广东药学院学报，2011，27(3):243-246.

［3］梅艳，宋新文，汪洋.固相萃取高效液相色谱法测定氯氮平血药浓度［J］.中国临床药理学杂志，2012，28(6):456-457.

［4］李冬梅，丁学开，梁民琦，等.固相萃取用于血浆中抗癫痫药物的提取［J］.中国现代应用药学，1999，6(16):132-134.

［5］鱼爱和，刘平，范武峰，等.测定氯氮平血药浓度临床意义的探讨［J］.中国临床药理学杂志，1994，10(1):27-31.