人SUMO病毒载体构建及稳转神经母细胞瘤SHSY5Y细胞系的建立

常 晶，陆 菡，薛庆生，于布为

(上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海 200025)

小泛素化相关修饰蛋白(SUMO)是一种新的类泛素家族成员，SUMO化介导的蛋白翻译后修饰是调控神经元功能的重要机制［1～3］。脊椎动物SUMO家族有SUMO1～4四个成员，除SUMO4仅在肾、淋巴结、脾脏表达外［4，5］，SUMO1 ～3 均在神经系统及其他系统内广泛表达。SHSY5Y细胞系属人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞系的一个亚类，不仅形态类似神经元，在功能方面也表现出活体神经元的特点［6］。2012年9～11月，我们将具有嘌呤霉素抗性的逆转录病毒载体与疱疹性口腔炎病毒糖蛋白G基因(pVSVG)及HIV的gag-pol基因共转染293T细胞，形成高滴度的逆转录病毒，感染SHSY5Y细胞以构建表达SUMO的稳转细胞系，旨在为进一步研究SUMO在中枢神经系统中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞(低分化)购于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。293T细胞购于中国科学院细胞库。pcDNA3.0-HASUMO1、pcDNA3.0-HA-SUMO2、pcDNA3.0-HA-SUMO3质粒及 pBabe-3×Flag-pruo、pVSVG和 gag-pol质粒均由上海交通大学医学院细胞信号转导实验室程金科教授惠赠。DMEM培养液购自Gibco公司，感受态Top10与DNA凝胶纯化试剂盒购自天根科技，限制性内切酶及DNA连接试剂盒均购自Promega公司，反转录试剂盒购自Takara公司，转染试剂 LipofectamineMT2000购自 Invitrogen公司，Flag M2抗体购自Sigma公司。引物合成服务由上海生工生物工程有限公司提供，质粒测序由北京六和华大基因科技公司完成。

1.2 实验方法

1.2.1 pBabe-3 ×Flag-SUMOs-puro的构建 pBabe-3×Flag-puro在pBabe-puro质粒基础上改造而来。用EcoRⅠ和 XhoⅠ双酶切 pcDNA3.0-HA-SUMO1、pcDNA3.0-HA-SUMO2、pcDNA3.0-HA-SUMO3 质粒，用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切pBabe-puro载体，酶切产物经琼脂糖电泳后，分别回收并纯化相应DNA片段。用DNA连接酶将二者酶切产物连接。16℃过夜。连接产物转化感受态细菌Top10，37℃过夜。酚—氯仿初步筛选后选阳性克隆进行扩增，碱裂解法提取pBabe-3×Flag-SUMOs-puro质粒。

1.2.2 pBabe-3 × Flag-SUMOs-puro 的鉴定 用EcoRⅠ、XhoⅠ和SalⅠ分别单酶切重组表达载体，经1%琼脂糖凝胶电泳初步检测片段长度后测序证实。DNA测序鉴定:SUMO1、SUMO2、SUMO3通用上游引物为:5'-CGGGATCCATGTACCCATACGATGTT-3';SUMO1下游引物为:5'-CCGCTCGAGCTAAACTGTTGAATGACC-3';SUMO2下游引物为:5'-CCGCTCGAGTCAGTAGACACCTCCCGT-3';SUMO3下游引物为:5'-CCGCTCGAGCTAGAAACTGTGCCCTGC-3'。

1.2.3 病毒包装 取处于对数生长期的293T细胞传代，待细胞达到75%密度时转染。将测序正确的pBabe-3×Flag-SUMOs-pruo的质粒、pVSVG和 gagpol共同转染293T细胞，同时设立空载体对照组(MOCK组)。目的质粒、pVSVG和gag-pol的转染比例为1∶1∶1。48 h后收集逆转录病毒上清，经0.45 μm滤器过滤、分装，-80℃冰箱保存。

1.2.4 pBabe-3 ×Flag-SUMOs-SHSY5Y 稳转细胞系的建立

1.2.4.1 SHSY5Y 细胞嘌呤霉素最小致死浓度的确定及稳定表达抗性细胞株的筛选 取24孔板接种适量SHSY5Y细胞，待细胞达到75%密度时，加入不同浓度的嘌呤霉素(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg/mL)，每一浓度设3个孔，2 d后根据细胞死亡情况确定嘌呤霉素对SHSY5Y细胞的最小致死浓度。待6孔板中SHSY5Y细胞融合度达75%时，分别加入1.5 mL包装了3×Flag-SUMO1、3×Flag-SUMO2和3×Flag-SUMO3质粒的病毒上清于37℃、5%CO2培养箱培养24 h后，更换为含6 μg/mL嘌呤霉素的筛选培养基培养，2～3 d换液1次，并重新加入嘌呤霉素。待未加入病毒感染的培养基内SHSY5Y细胞(Mock组)死亡后，有抗性克隆集落长出时继续加入嘌呤霉素培养。

1.2.4.2 pBabe-3 × Flag-SUMOs-puro 在 SHSY5Y单克隆细胞中的表达测定 采用Western blot法将筛选获得的pBabe-3×Flag-SUMOs-puro细胞单克隆分别用胰酶消化收集细胞，PBS洗涤后加入2×SDS超声裂解，4℃、12000 r/min离心20 min，取上清分装。取适量蛋白稀释后进行蛋白定量。将各样品蛋白稀释至相同浓度，100℃水浴10 min，等量加入10% ～12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，并电转入PVDF膜中，用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入稀释的抗Flag抗体，室温孵育1 h，TBST洗3次(5～10 min/次)。二抗(辣根过氧化物酶连接的羊抗鼠抗体)孵育1 h，TBST洗3次(5～10 min/次)。采用FUJIFILM LAS-4000光成像系统进行图片显像。

2 结果

2.1 pBabe-3×Flag-SUMOs-puro的鉴定 将构建的pBabe-3×Flag-SUMOs-puro质粒经DNA测序，结果显示SUMO1、SUMO2、SUMO3及MOCK组的模板均成功构建于pBabe-3×Flag-puro载体上，序列完全正确，与目的序列相同。

2.2 pBabe-3×Flag-SUMOs-puro在 SHSY5Y 细胞中的表达 Western blot结果显示抗Flag的抗体能检测到通过病毒转染的pBabe-3×Flag-SUMOs-puro在SHSY5Y细胞中的表达，由图1可以看出，病毒转染pBabe-3×Flag-SUMOs-puro的SHSY5Y细胞中SUMO1、SUMO2、SUMO3的含量明显多于 MOCK组。同时，只有转染pBabe-3×Flag-SUMOs-puro的SHSY5Y细胞能被Flag抗体在相应的位置检测到条带。见图1。

图1 SUMO1、SUMO2、SUMO3 在 SHSY5Y细胞中的表达(Western blot法)

3 讨论

SUMO化介导的蛋白翻译后修饰被认为是调控神经元功能的重要机制。SUMO能可逆地与靶蛋白赖氨酸残基进行多肽共价修饰，从而调节底物功能［1］。SUMO化修饰广泛参与了基因转录的调控、细胞周期的调控、蛋白翻译后修饰等过程，在信号转导、核质运输、泛素化的拮抗等方面均发挥重要作用。SUMO化修饰的理论基础为蛋白质学说，其发生与去除都能够改变蛋白质的功能。除了已经发现的膜蛋白外，SUMO化修饰蛋白大多属于细胞信号转导通路，在转录因子的转录开放过程中发挥着重要作用，最终能够影响一系列基因的转录水平［7］。然而，SUMO体系的许多特点增加了研究的难度，比如修饰水平普遍较低，在生理状态下存在大量去SUMO化酶系，SUMO相关蛋白复合体系形式多样，发挥作用的酶和底物种类繁多等［2］。因SUMO修饰水平低，对研究的灵敏度和准确度提出了更高的要求。因此排除诸多干扰因素，对SUMO体系进行确切的分析，就要求建立针对SUMO修饰的特定研究工具，人SUMO稳转的细胞系即是诸多研究工具中的一种。由于无论在人体内或体外组织细胞中SUMO化的修饰水平均较低，不容易被观察和检测到，因此，通过构建SUMO表达的稳转细胞系来放大SUMO化修饰的变化趋势，使其易于观察和检测就成为研究SUMO这一蛋白翻译后修饰的首要环节。鉴于常规的脂质体等方法转染SHSY5Y细胞效率较低，本研究选用逆转录病毒作为转染工具，通过病毒感染稳转pBabe-3×Flag-SUMOs-puro质粒，使SUMO1～3在SHSY5Y细胞系中有一定的高表达，对SUMO修饰的增减变化起了放大的作用，并通过Flag对SUMO进行标记，选用抗Flag抗体进行放大，增加了SUMO变化的可检测性，很好地解决了商品化的SUMO抗体因检测的特异性和灵敏性偏低对结合态和游离态的SUMO蛋白表达显示不清晰的问题。

目前大多数转染实验使用的是脂质体转染，转入细胞的基因表达会随着细胞的传代逐渐降低。而经逆转录病毒系统包装后的外源基因可以稳定高效地整合入宿主基因组，稳定介导基因表达;包装成熟的病毒颗粒以出芽生殖的方式进入到细胞培养液上清液中，易于与宿主细胞分离，制备方便［8，9］。本研究通过酶切与亚克隆技术成功构建了重组逆转录病毒质粒pBabe-3×Flag-SUMOs-pruo，通过转染及筛选产生高滴度逆转录病毒颗粒，并感染SHSY5Y细胞，得到了稳定表达的 pBabe-3×Flag-SUMOs-SHSY5Y细胞系，为进一步研究SUMO在神经系统蛋白翻译后修饰及信号转导中的作用奠定了基础。

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