果蔬中酚类成分及其与蛋白质相互作用的研究进展

范金波，周素珍，郑立红，任发政，吕长鑫，冯叙桥，*

(1.渤海大学食品科学研究院，辽宁省食品安全重点实验室，辽宁锦州121013;2.河北科技师范学院，食品工程系，河北昌黎066000;3.中国农业大学，食品科学与营养工程学院，北京100083)

果蔬是膳食的重要组成部分，无论是鲜食还是加工品在日常生活中都占有重要的地位。随着人们生活水平的提高，人们对于食品的要求越来越高，更倾向于食用富含功能活性成分的食品。研究表明，果蔬作为植物源性食品原料，富含功能活性成分，包括膳食纤维、酚类、烯丙基硫化物、类胡萝卜素、植物固醇等［1］。植物多酚是植物体内的一种次生代谢产物，具有抗氧化、抗癌、抗辐射、降血压、预防心脑血管疾病等多种功能活性［2－5］。果蔬在加工、储藏、食用等过程中，其中的活性成分会与蛋白质发生作用，进而影响食品的色泽、风味和营养价值，并改变或影响多酚和蛋白质的功能特性。因此，国内外学者近年来就多酚与蛋白质相互作用进行了大量研究。常用的研究方法包括紫外－可见吸收光谱法、荧光光谱法、圆二色谱法、傅里叶变换红外光谱法、平衡透析法、液相色谱法等，随着实验技术进步，质谱、核磁共振、毛细管电泳、激光拉曼散射等方法的应用日益增多。另外，计算机分子模拟技术可以在分子水平上研究小分子与蛋白质相互作用的信息。利用这些方法可以获得关于多酚－蛋白质复合物作用的结合常数、结合位点数、结合位置、作用力类型等信息。研究表明多酚－蛋白质复合物主要是靠氢键和疏水相互作用维系，多酚－蛋白质相互作用在不同的体系中受诸多因素的影响［6］。本文综述了果蔬中的酚类成分，并对其与蛋白质的相互作用进行了探讨，以期为了解活性成分对食品质量的影响和促进活性成分的应用提供参考。

表1 常见果蔬中的酚类成分Table 1 Common phenolic compounds in fruits and vegetables

1 果蔬中的酚类成分

酚类化合物指芳香烃中苯环上的氢原子被羟基取代所生成的化合物，是植物的重要次生代谢产物。酚类化合物对于植物的生长发育、抗病害、抗胁迫等起着重要的调节作用［7］，对植物源食品的色泽、风味及抗氧化活性等都有非常重要的影响［8］。酚类根据其分子所含的羟基数目可分为一元酚和多元酚或多酚(即单宁)。酚类具有优良的抗氧化性，其酚羟基极易被氧化，对自由基有很强的捕捉能力［9］。多酚具有抗氧化、抗癌、抗辐射、降血压、预防心脑血管疾病、抑制神经变性等生物学活性［2－5］。酚类成分主要包括单宁、类黄酮、酚酸、木质素等。常见果蔬中的酚类成分见表 1［10－13］。

1.1 单宁

单宁即多酚，是分子中具有多个羟基的酚类成分，广泛存在于蔬菜和水果的皮、根、叶、果中，现在发现大约有8000多种［14］。最近对于食用多酚的研究主要集中在它们的保健及抗氧化特性上。人摄入富含多酚食品的多少与人患癌症、心血管疾病的机率关系紧密，多酚的摄入具有一定的预防和保护作用［15］。多酚具有防御病毒、保护植物的作用，在植物的生长中扮演重要角色，赋予植物颜色和某些特性［16］。人工合成抗氧化剂如 BHA(Butyl Hydroxy Anisd，丁 基 羟 基 茴 香 醚)、BHT(Butylated Hydroxytoluene，二丁基羟基甲苯)等由于其潜在的危害已经被限制使用，多酚作为天然抗氧化剂替代合成抗氧化剂已经成为发展趋势。目前果蔬多酚物质研究的热点主要有苹果多酚和葡萄多酚［17－18］。近年来，研究发现苹果多酚有极强的抗氧化活性，10mg/mL时对羟基自由基的清除率高达90%，同时在1～10mg/mL范围内清除率与多酚浓度呈正相关［19］。Petti 和 Scully［20］研究发现:苹果多酚具有抑制牙周致病菌活性，从而有效抑制牙龈疾病的发生和预防口腔癌。还有其它研究表明:苹果多酚具有抗辐射性和降低胆固醇的作用［21－22］。

1.2 类黄酮

类黄酮是一大类以苯色酮环为基础的酚类化合物，分为黄酮、黄酮醇、黄烷醇、黄烷酮、黄烷酮醇、花色素苷、异黄酮等，广泛存在于苹果、香蕉、草莓、南瓜、胡萝卜、西红柿等水果、蔬菜中。最初黄酮类化合物生物活性的研究主要集中在对自由基的清除上［23］，最近研究表明，类黄酮还具有抗癌、改善心血管疾病、抗过敏、抗炎、抗菌和酶的抵制、雌激素作用等活性［24］。Day 和 Williamson［25］在 1999 年研究了类黄酮物质的摄入量与人体慢性病之间的关系，对805名65岁到84岁间的荷兰老年男子进行过为期5年的实验观察，在这5年时间里主要通过控制摄入茶叶、洋葱、苹果等使类黄酮的摄入量平均每人每天为26mg，结果发现冠心病的死亡率与类黄酮物质的摄入量呈现明显的负相关。人们对以槲皮素为代表的黄酮醇类物质的生理活性尤其是抗氧化作用，即对氧自由基以及脂质过氧化物的清除能力的研究，也日益增加［26］，这些生物学性质又可能与癌症、动脉硬化及其它一些炎症的病理条件有关［27］。

2 果蔬多酚与蛋白质的相互作用

在食品工业中，酚类与蛋白质的相互作用会直接影响到食品本身的品质。如长期放置的啤酒、果汁、复合饮料会产生混浊现象，当加入蛋白酶时浑浊消失，主要是由于放置过程中蛋白质与多酚聚合沉积［28］。近年来，多酚在食品、药品、化妆品领域有越来越广泛和深入的应用，这一切都源于人们对于多酚与蛋白质相互作用规律的认识。因此，只有更科学地认识多酚与蛋白质的相互作用机制，才能更加广泛和科学地应用多酚。

2.1 多酚与蛋白质相互作用的原理

近年来，国内外学者对多酚蛋白质相互作用机制进行了大量的研究。最初研究认为它们的复合是氢键所致，随着研究的深入，现已经确认多酚与蛋白质的结合主要由氨基酸侧链与多酚芳环间的氢键、疏水作用等弱相互作用所致。研究认为引起啤酒混浊的蛋白质主要为大麦醇溶蛋白，混浊量与蛋白质中脯氨酸含量呈线性关系，而对于不含脯氨酸的蛋白质则不产生混浊现象［29］。进一步的研究表明，多酚对于蛋白质的结合具有选择性，不同的多酚对于不同的蛋白质结合能力差异很大［30］。茶多酚类化合物对β－乳球蛋白有较强的亲和能力，多酚与蛋白的结合减少了无规卷曲结构的比例，同时使α－螺旋结构和β－折叠的比例增加，从而提高了β－乳球蛋白的稳定性，稳定性随着多酚分子大小、浓度的增大而增强［29］，而且相对分子质量较大，结构开放较松散，脯氨酸或其它疏水性氨基酸含量较高的蛋白质对多酚表现出高亲和性［30－31］。多酚－蛋白质结合是分子识别的典型例子，不仅要考虑蛋白质的分子组成、结构和构型，同时也要考虑多酚的结构和构型。Haslam等［32］认为，可用“手－手套”模型来说明此反应，蛋白质分子中疏水基团较集中的部位构成“疏水袋”就形成“手套”部分，而多酚分子进入其中并通过氢键结合形成“手”部分。Hasni等［33］通过结构模型发现茶多酚与乳蛋白结合时几种氨基酸残基对于氢键网络的形成起到重要的作用。

2.2 相互作用对多酚功能活性的影响

多酚与蛋白质相互作用的同时会影响多酚物质的活性。Rawel等［34］研究表明蓝莓汁和牛奶同时被人体摄入时会降低蓝莓的抗氧化活性;β－乳球蛋白与茶多酚形成复合物时，随着多酚分子体积的增大，结合能力增强，导致供电子能力减弱，从而降低了茶多酚的抗氧化活性［35］。Arts 等［36］研究表明黄酮类物质与血浆白蛋白作用后，黄酮的抗氧化活性降低。余丹丹等［37］研究表明咖啡酸与乳蛋白结合导致咖啡酸的抗氧化能力受到不同程度的抑制。Mariana等［38］研究表明乳清蛋白的存在对不同的阿根廷绿茶抗氧化活性和抗菌活性具有一定的掩盖作用，且随着乳清蛋白浓度的增加而增强。大量的研究都证实了多酚与蛋白质相互作用会使多酚类物质抗氧化和抗菌等活性受到一定程度的抑制，因此在单独考虑多酚类物质功能活性时，应尽量避免与蛋白质类食品同时摄入，以减少活性的损失。

2.3 相互作用对蛋白质功能特性的影响

许多研究都已经证实，多酚与蛋白质相互作用的同时也会影响蛋白质的功能特性。单宁与蛋白质可以形成复合物而降低食品的营养价值，同时可与消化酶形成络合沉淀从而抑制消化酶活性，影响机体对营养成分的吸收［39－40］。

蛋白质功能特性包括水合作用、界面性质和结构性质，具体包括蛋白质的溶解性、吸水性、黏弹性、乳化性、起泡性、凝胶作用等［41］。不同蛋白质－多酚相互作用对蛋白质功能特性的影响也各不相同，绿茶多酚可有效地增强β－乳球蛋白的发泡能力和改善其泡沫稳定性，其主要原因是蛋白质－多酚的相互作用增强了界面蛋白质之间形成的疏水键和氢键［42］。茶多酚可以显著改善蛋白质起泡特性和凝胶性，Seshadri等［43］指出茶多酚能够显著改善蛋清蛋白的发泡特性;吴卫国等［44］实验证明1.0%的鸡蛋蛋清溶液中加入0.25%的茶多酚时，鸡蛋蛋白的发泡能力和发泡稳定性增加4～5倍，而且发现茶多酚的加入改变了凝胶强度和凝胶温度。另外研究证实，茶多酚能显著地提高大豆分离蛋白的起泡性和泡沫稳定性，但对其乳化特性无显著性影响［45］。蛋白质的改性是食品工业发展的需要，酶法和非酶法改变都存在一定程度的缺陷或危害，目前科学家仍在寻找新的改性方法，多酚的出现及其在食品中越来越多的应用，给蛋白质改性提供了新的途径［14］。

3 多酚与蛋白质相互作用的研究方法

小分子与蛋白质相互作用的研究是化学生物学的重要内容，该研究能为生命科学、化学、食品营养学等提供丰富的信息资源。常用的方法主要有光谱法、电化学方法、色谱法，其中光谱法应用最广泛，包括紫外－可见吸收光谱法、荧光光谱法和傅里叶变换红外光谱法。通过这些方法可以获得蛋白质与小分子配体作用的结合常数、结合位点数、结合位置、作用力类型以及蛋白质结构与功能变化等信息。本文重点介绍紫外－可见吸收光谱法、荧光光谱法和傅里叶变换红外光谱法在多酚与蛋白质相互作用方面的应用和研究进展。

3.1 紫外－可见吸收光谱法

蛋白质中芳香族氨基酸色氨酸(吲哚基)、酪氨酸(酚基)、苯丙氨酸(苯基)因含有特定的基团，在紫外区有吸收。一般在蛋白质的紫外吸收光谱中，280nm处是酪氨酸、色氨酸的吸收峰，257nm是苯丙氨酸的吸收峰，210nm是肽键的吸收峰［46］。当向蛋白质中加入小分子物质后，往往导致蛋白质生色基团紫外吸收光谱的变化，据此可以了解氨基酸微环境的变化，结合后紫外吸收光谱发生变化就说明蛋白质的构象发生了变化［47］。文鹏程等［48］利用紫外光谱法研究了不同小分子物质对于蛋白质构象的影响，结果表明二硫苏醇对乳铁蛋白二硫键破坏最严重，超过总二硫键含量的55%，盐酸胍和巯基乙醇对二硫键破坏较少。借助于紫外吸收光谱可辅助判断小分子对蛋白质的荧光猝灭机理［49］，计算小分子与蛋白质的结合常数。Hasni等［43］利用光谱计算了酪蛋白与不同茶多酚结合的结合常数，与荧光法计算结果比较没有明显的差异。

余丹丹等［37］通过紫外吸收光谱和荧光光谱研究了咖啡酸与乳蛋白结合的光谱学特性，结果表明咖啡酸会使乳蛋白发生内源性荧光猝灭，咖啡酸与α－酪蛋白之间以静电引力结合，与β－酪蛋白、α－乳白蛋白的结合作用力为氢键，与κ－酪蛋白β－乳球蛋白是以疏水作用力结合。两者结合距离符合非辐射能量转移条件，证明咖啡酸对乳蛋白的荧光猝灭是由于生成不发光的配合物而引起的静态猝灭。刘媛等［50］通过紫外光谱分析研究了贝加因黄酮与不同异构体人血清白蛋白相互作用的机制，结果表明在弱碱性条件下，贝加因的紫外吸收光谱发生了明显的变化，说明其A环上的羟基发生了解离，而在pH4.5～2.0范围内，贝加因的结构基本保持不变;贝加因与不同异构体的人血清白蛋白作用后，其紫外光谱吸收I带发生显著的红移，显示出药物与蛋白质发生了特异性的结合。

3.2 荧光光谱法

荧光光谱法是研究生物大分子与小分子相互作用应用最广泛的一种方法［51］，该方法可以提供较多的荧光参数如激发光谱、发射光谱、荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等。这些参数能够反映分子的结构和发光特性，根据这些参数可以对蛋白质进行定量分析和结构预测［52］。研究者常利用蛋白质自身的内源荧光作为探针，内源荧光主要来源于酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸残基，由于苯丙氨酸量子产率低、酪氨酸电离后荧光几乎全部猝灭，因此色氨酸最常被用作内源探针来研究蛋白质的构象及其与小分子的相互作用［52］。

荧光光谱法包括荧光猝灭法、荧光增强法、同步荧光、荧光偏振等，其中蛋白质与小分子相互作用常采用荧光猝灭法。所谓荧光猝灭是指荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。荧光猝灭可分为静态猝灭和动态猝灭，两种猝灭都遵循 Stern－Volmer方程［53］。通过荧光光谱可以获得蛋白质与小分子配体作用的结合常数、结合位点数、结合位置、作用力类型等信息。

刘媛等［50］利用荧光光谱证实贝加因对不同异构体的荧光猝灭机制主要为静态猝灭过程，通过药物对蛋白质的荧光猝灭实验，计算出了它们之间的结合常数。研究结果表明，药物与蛋白质的结合常数随pH的降低而减小;与不同异构体蛋白质作用后，药物的荧光发射峰有显著的增强效应。实验结果充分证明贝加因与不同异构体的蛋白质之间形成了复合物，药物分子结合在蛋白质IIA亚域邻近色氨酸残基的SiteI结合位点。

3.3 傅里叶变换红外光谱法

近红外光谱可提供的信息十分丰富，包括物质的组成、构象、结晶、分子内和分子间相互作用，十分适合于聚合物的研究分析［54］。近年来近红外光谱技术逐渐发展成为最引人注目的分析手段之一。在蛋白质结构分析中，红外光谱有其突出的优点，它适用于不同状态、不同浓度及不同环境中蛋白质和多肽的测定。目前已经成为研究蛋白质二级结构变化的有力手段之一［55］。

Holly 等［56］和 wang 等［57］利用红外光谱技术来测试多肽链并建立了初步的峰位归属。Izutsu等［58］将近红外技术应用于蛋白质溶液和冻干的样品中，通过对比牛血清蛋白、溶解酵素、卵清蛋白、球蛋白等一系列蛋白质的近红外特征谱，来探究蛋白质在溶液状态中和冻干后的二级结构变化。结果证明近红外确实能够提供构象相关信息，α－螺旋和β－折叠分别对应特有的吸收峰，峰强会随着构象变化而发生变化。除了不会对样品造成任何破坏，近红外光谱还具有动态跟踪蛋白质结构变化过程的优势。

4 结语

人们对多酚－蛋白质相互作用进行了大量的研究，取得了一定的成果，但是对于多酚蛋白质相互作用的机制并不明了。多酚蛋白质除了受到自身结构、大小等因素的影响外，同时受其在食品体系、人体代谢过程中等环境因素影响，为了更好地研究多酚蛋白质相互作用的机理，还需要在分子水平上进行深入研究，如参与复合的蛋白质的空间结构、构象改变，相互作用对多酚生物活性和对蛋白质功能特性的影响等。这些深入研究将有助于多酚在食品、化工、医药等领域中的广泛应用，对于提高天然抗氧化剂多酚的综合利用具有重要意义。

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