原子力显微镜观察DNA与内切酶的相互作用

李超英， 黄先恺， 杨光参， 王艳伟

(1．上饶师范学院物理与电子信息学院，江西上饶334001;2．温州大学物理与电子信息工程学院，浙江温州325035)

0 引言

DNA与蛋白质分子的相互作用在许多生物过程中起着非常重要的作用，如DNA修复、复制与转录等［1-3］。DNA与蛋白相结合的精确位点的测定与观察对于研究复杂细胞体系的机理与功能，特别是研究基因表达的控制十分关键［4-6］。限制性核酸内切酶根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子至少可分为四类。Ⅱ 型限制与修饰系统所占的比例最大，达93%。限制性内切酶在一定条件下能识别并切割特异的双链DNA序列，但实际上内切酶与DNA的作用方式很多，这与内切酶、DNA的种类及缓冲液的条件等有一定关系。大多数内切酶与DNA的相互作用都需要二价镁离子作为催化辅助因子。在镁离子存在下，内切酶具有很大的切割活性，内切酶会识别4～8碱基对的特异的序列，然后会在该识别位点上或附近切割DNA［7-9］。在锰离子存在的条件，内切酶具有很小的切割活性;但在钙离子存在的情况，内切酶没有活性。原因是钙离子可以模仿镁离子产生特异性蛋白-金属-DNA复合物，这种稳定的三元复合物阻碍内切酶对DNA的切割活性，反而增加结合性［10-11］。如EcoRV是一种小的内切酶，通过二聚体的形式与DNA发生作用，其识别序列是5’-GATATC-3’［12］。IIS 型内切酶BspMI识别不对称的序列5’-ACCTGC-3，然后在该位点旁边上下的第4与第8个碱基对处切割［13］。在溶液中，这种内切酶以四聚体形式存在，含有相同的子单元［14］。BspMI对DNA的切割一般先结合2个识别位点导致4个磷酸二脂键的断裂，然后再与DNA分离，这与切割一个位点的内切酶不同［15］，所以，如果缓冲液中钙离子代替镁离子时，这种内切酶与DNA的结合会出现环状结构［16］。

原子力显微镜(AFM)作为一种高度分辨率可达0．1 nm左右，宽度分辨率可达2 nm左右的表面分析仪器，已广泛地使用于观察各种DNA与蛋白质的相互作用，是研究这种作用最直接方便的操作方式［17-18］。本文用AFM研究内切酶EcoRV、BspMI与 λ-DNA的结合，内切酶EcoRV与λ-DNA有21个识别位点，内切酶BspMI与λ-DNA有41个识别位点，除了此结合位点外，也会有一些非特异性结合。由于作用方式的不同，结合的最终 AFM图像明显不同。本文主要用AFM对其不同作用方式的内切酶与DNA的结合给出直接的证据，说明其弯曲效果与成环结构。

1 AFM实验原理

在AFM系统中，使用微小悬臂来感测针尖与样品之间的相互作用，该作用力会使微悬臂摆动，当摆动发生时，会使照在悬臂末端的激光的反射光位置改变而造成偏移量，此时四象限激光检测器会记录此偏移量;然后把此时的信号传给反馈系统，以利于系统做适当的调整;最后再将样品的表面特性以影像的方式呈现出来。

AFM与样品间的相互作用以范德华力为主，其作用势能一般用Lennard-Jones势能函数表示:

式中:r是势能为0时两原子的核间距;ε是势阱深度，是势能曲线上最低点势能的绝对值。当悬臂尖端的原子与样品靠近，开始时吸引力起主导作用;随着距离的减小，两者之间的吸引力与排斥力将趋于平衡。当两原子进一步靠近时，范德华力以斥力为主。

AFM的工作模式主要有:①“恒力”模式，是使用最广泛的扫描方式，针尖与样品间的作用力与距离有强烈的依赖关系，所以在扫描过程中利用反馈回路保持针尖与样品之间的作用力恒定，即保持微悬臂的形变量不变，针尖就会随样品表面的起伏上下移动，记录针尖上下运动的轨迹即可得到样品表面形貌的信息，完成样品扫描任务。②“恒高”模式，即在X，Y扫描过程中，不使用反馈回路，保持针尖与样品之间的距离恒定，通过测量微悬臂Z方向的形变量来成像。这种方式通常在观察原子、分子像时用得比较多，可以采用很高的速度，但对于表面起伏比较大的样品不适用。

2 材料与方法

2．1 材 料

噬菌体λ-DNA(NEB公司)，用前不需要进一步纯化。λ-DNA的原始浓度500 ng/μL，储存液1×TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl与 1 mmol/L EDTA，pH 8．0)。限制性内切酶 EcoRV与 BspMI(Sigma-Aldrich公司)，其原始浓度是5 u/μL。分析纯氯化钙及其他的化学药品(北京经科宏达公司)。实验中用水都是超纯水，经过密理博超纯水系统过滤、去离子化处理。云母做成1 cm×1 cm的正方形，每次用前用透明胶新解离后使用，以保证云母片表面的平整度与清洁。

2．2 AFM 成像

AFM(日本京都岛津公司，型号为SPM-9600)。所有的图像都是在空气中采用轻敲模式获得。扫描速度3 Hz，均方振幅2 V，驱动频率约350 kHz，硅探针具有固定的弹性系数42 N/m。图片512×512像素。在AFM图像中DNA高度、宽度等信息出SPM-9600自带的离线分析软件获得。

2．3 AFM样品准备

λ-DNA(500 ng/μL)的贮存液用含有10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl和 10 mmol/L CaCl2的缓冲液稀释。DNA的最终浓度是1．25 ng/μL。接着把不同单位浓度的内切酶与DNA溶液混合，然后把混合液放到37℃的干式恒温器内放置30 min，用移液器取出15μL的混合液放到刚解离的云母片上面，沉积2min后，每次用20μL的Milli-Q超纯水冲洗云母片，约冲洗10～15次，目的是去除云母表面多余的DNA分子，最后立即用氮气吹干待用。

3 结果与讨论

本文用AFM研究了II型限制性内切酶EcoRV与λ-DNA的相互作用。一般情况下，内切酶对DNA有切割作用，但是用镁离子代替缓冲液中的钙离子后，内切酶的切割作用会被阻止。此时这种内切酶以二聚体形式绑定DNA的序列5’-GATATC-3’，会形成一个一个珠串状结构，如图1所示。在λ-DNA分子上面，这种序列出现过21次，随着内切酶浓度的增加，DNA上面结合位点数也不断增加，因此，如果每个位点都结合上内切酶的话，一根DNA上面应该有21个点。但是由图2知，当内切酶浓度达到5 u/mL时，单根DNA上面结合位点的统计结果显示不止有21个，可见在特异性结合的同时，也有一些非特异性结合。而且在图1(C)黑色圆圈中明显看出DNA上面内切酶结合的地方，DNA会发生弯曲，说明EcoRV对DNA还有扭转弯曲的作用。

图1 EcoRV与DNA相互作用的AFM图像

图3 是IIs型限制性内切酶BspMI与DNA的相互作用的AFM图像，用钙离子代替缓冲液中的镁离子后，内切酶对DNA没有切割作用，这种内切酶会以四聚体形式结合到DNA的单个序列5’-GAATTC-3’或绑定2个DNA的序列形成环状结构。在λ-DNA分子上面，这种序列出现过41次。在实验过程中，发现有些蛋白并没有绑定2个DNA序列而形成环，而是会绑定到DNA的一个识别位点，如图3(D)黑色圆圈所示。改变内切酶浓度，在云母片上面观察BspMI-DNA的复合物，在图3中可以看到，绑定单个位点或2个位点而形成环的两种情况。当内切酶BspMI的浓度很高时，就会有更多的环状形成。图4为DNA上面内切酶的结合位点数量统计图，随着内切酶浓度的增加，绑定单个位点及2个位点形成环状结构的数量都在增加，统计时把成环结构看成2个位点绑定进行统计。由图4可知，内切酶浓度达到5 u/mL时，DNA上面的环状结构很多，而且对单根DNA上面内切酶的结合数量进行统计也不止41个，说明也有非特异性的结合，而且发现内切酶的体积变大，可能发生内切酶之间的聚集。

图2 EcoRV与DNA相互作用结合位点的统计图

图3 BspMI-DNA复合物的AFM图像

图4 BspMI与DNA相互作用结合位点的统计图

图5 是两种内切酶与DNA作用的模型图，能够更直观形象地说明其相互作用。在钙离子缓冲液中，两种内切酶与DNA结合作用是不同的。限制性内切酶EcoRV是二聚体的结构，与DNA的单个位点结合，并使DNA发生弯曲，形成珠串状结构，如图5(A)所示。BspMI是四聚体的结构，四聚体有2个识别位点，BspMI与DNA结合作用或结合一个位点形成珠串状结构，或结合2个位点形成环状结构，如图5(B)所示。

图5 两种内切酶与DNA作用的模型图

4 结语

本文利用AFM研究λ-DNA与内切酶蛋白的相互作用，主要对两种内切酶与DNA的成像进行对比。该方法不仅可用于科学研究，还可引入近代物理实验教学。该实验的开设不仅可提高学生的动手操作能力，而且对生物学中重要的过程如DNA与内切酶的作用进行直接观察，拓宽学生们对生物学与物理学结合领域的认识。

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