甘蔗胚性愈伤组织的诱导和抗褐化研究

吴转娣 ，赵 俊 ，刘家勇 ，陈学宽 ，杨 昆 ，赵培方 ，李纯佳 ，吴才文

（1.云南省农业科学院甘蔗研究所，开远 616699；2.云南省甘蔗遗传改良重点实验室，开远 616699；3.云南云蔗科技开发有限公司，开远 616600）

甘蔗是我国最主要的糖料作物，对发展国民经济有十分重要的意义[1－2]。抗旱强宿根高产高糖甘蔗新品种的选育对甘蔗糖业的可持续发展尤为重要。“十一五”以来，云南省农业科学院甘蔗研究所先后选育并推出了云蔗06-407、云蔗03-194、云蔗03-258和云蔗05-51等多个强宿根、高产高糖、抗旱性强的甘蔗新品种。甘蔗组织培养是提高甘蔗繁育效率，降低繁种成本的重要手段，并被广泛应用于研究甘蔗生理、甘蔗快繁、甘蔗突变体育种、病毒去除以及甘蔗转基因研究等。基于甘蔗不同基因型品种之间的组织培养体系存在较大的差异，本研究以云蔗06-407、云蔗03-194、云蔗03-258和云蔗05-51为研究材料开展组培快繁研究，旨在研究建立甘蔗新品种（系）的组织培养体系，加快甘蔗新品种的繁殖速度，为蔗区提供充足的种苗来源，加快其在蔗区的推广应用与成果转化。

甘蔗组织培养受到诸多因素的影响。首先，基因型是影响组织培养重要因素之一，不同材料，其培养能力不同。梁计南等[3]认为不同基因型甘蔗在同样的培养条件下，外植体的褐变率、愈伤组织的诱导率、增殖率、分化率都表现出显著的差异。黄惠芳等[4]在甘蔗组织培养研究中提出2，4-D是甘蔗愈伤组织诱导中最常用也是效果最好的激素。甘蔗愈伤组织可以在仅含2，4-D的培养基上诱导形成；愈伤组织转到分化培养基上继续培养可形成再生植株[5]。本研究为探索诱导4个不同甘蔗品种产生胚性愈伤组织的最佳2，4-D浓度，使之能够诱导出较好胚性愈伤组织，为甘蔗的组培快繁和甘蔗转基因研究提供科学依据。

甘蔗是一种含多元酚类物质较高的作物，尤其是幼嫩茎和嫩叶鞘含量较高。顾之中等[6]报道在培养基中添加500mg/L脯氨酸能降低愈伤组织褐变死亡率；陈彪等[7]利用乙烯吡咯烷酮（PVP）做预处理或作为附加物添加到培养基中防止甘蔗组织培养褐变；秦新民[8]等在培养基中添加抗坏血酸等物质，在减轻酚污染上取得了一定成效。本研究拟探讨有效防止甘蔗组织褐化方法，建立高效甘蔗组织培养体系。

1 材料与方法

1.1 材料

云蔗06-407、云蔗03-194、云蔗03-258及云蔗05-51材料采自云南省农科院甘蔗研究所所内基地。

1.2 方法

1.2.1 愈伤诱导试验设计 从田间选取露节生长健壮、无病虫害的甘蔗尾鞘约30cm，剥去部分老叶，经75%酒精表面消毒后，再剥取甘蔗顶端生长点处的幼嫩叶片组织作为外植体。将外植体切成约1mm的薄片，接种于 5个不同处理的培养基中，培养基的配方为 MS+蔗糖 30g/L+2，4-D（0.5、1.0、1.5、2.0和 2.5mg/L）+卡拉胶8g/L+活性炭0.2g/L，pH5.8。

每个培养皿可接入16～20片，3皿为1个重复，每个浓度设置4个重复，于25℃下恒温暗培养。

1.2.2 抗褐变试验方法 以甘蔗03-258为试验材料，按照1.2.1的方法将甘蔗幼嫩叶切片接种于以下培养基中，每个培养皿接入16～20片，3皿甘蔗为1个重复，设4个重复。培养基配方见表1，其中，无添加培养基A作为对照，于25℃进行恒温暗培养。计算6种不同培养基中03-258材料的诱导率。

1.2.3 观察、记录与计算 以上每5d观察并记录各处理的愈伤组织诱导的情况。25d记录外植体诱导愈伤组织生长状况，并统计诱导率。诱导率计算方法：诱导率=诱导出愈伤组织的外植体数/接种数×100%。

对诱导出愈伤组织的质量进行分级，即分为-级和+级：

-级：稍有生长或长势一般，愈伤组织较小，半透明，愈伤组织松软、粘糊状，这类愈伤组织分化出苗率低，不具有胚性能力，无利用价值。

+级：长势较好，愈伤组织较大且色淡黄、质致密，表面光滑，此类愈伤组织叫胚性愈伤组织，具有很好的利用价值。

胚性愈伤组织的获得率=+级胚性愈伤组织数/诱导出愈伤组织的外植体数×100%。

表1 甘蔗03-258抗褐变培养配方

2 结果与分析

2.1 2，4-D对愈伤组织的影响

2.1.1 2，4-D对愈伤组织诱导率的影响 以心叶作为外植体，在5个不同2，4-D浓度下诱导愈伤组织。接种5d左右观察外植体圆片开始膨大，周边开始产生颗粒状的白色愈伤组织，培养7d后看到明显的愈伤组织团状物，此时的团状物几乎布满整个外植体圆片。

试验结果表明：平均诱导率较高的是云蔗03-194、云蔗05-51和云蔗06-407分别达59.2%、58.4%和57.3%，而平均诱导率较低的是云蔗03-258，只达到20.3%（见表2）；

表2 不同基因型、不同浓度2,4-D对愈伤组织及胚性愈伤组织诱导率的影响

通过双因素方差分析结果表明：云蔗06-407、云蔗05-51和云蔗03-194三个品种的愈伤诱导率没有显著性差异，而云蔗03-258的诱导率显著低于其它3个品种。云蔗06-407、云蔗03-194、云蔗05-51在不同2，4-D浓度中胚性愈伤组织生长存在差异，最适合它们生长的2，4-D浓度分别为2.0、1.0、1.5mg/L。

通过双因素方差分析结果表明：这3个品种在2，4-D浓度为1.0、1.5和2.0 mg/L的MS培养基中生长没有显著性差异。而在2，4-D浓度为0.5和2.5 mg/L的MS培养基中存在显著性差异。也就是说2，4-D浓度为0.5和2.5 mg/L的MS培养基不适于这4个甘蔗品种愈伤组织的生长。

2.1.2 2，4-D对愈伤组织生长状态及质量的影响 不同2，4-D浓度对愈伤组织发生速度有不同的影响，诱导形成的愈伤组织块性状差异也很大。从表2中可见，较高或较低两个处理中+级胚性愈伤组织所占比例较少，当2，4-D浓度在1.0～2.0mg/L时诱导率较高，+级的胚性愈伤组织较多。云蔗03-194和云蔗05-51在2，4-D浓度为1.0mg/L时，胚性愈伤组织的质量最好，云蔗06-407则在1.5mg/L 2，4-D的培养基中，获得的胚性愈伤质量最好。云蔗05-51在2，4-D浓度为1.5mg/L时，诱导率最高，但是在1.0mg/L 2，4-D培养基中获得质量最好的愈伤组织。在低浓度下获得最好质量的愈伤组织，可以有效地减少变异，因此，我们认为最适合云蔗05-51的诱导培养的2，4-D浓度为1.0mg/L。

双因素方差分析结果表明：云蔗03-258与另外3个品种存在显著性差异，但未达到极显著水平。4个甘蔗品种在2，4-D为1.0、1.5、2.0mg/L三个浓度下不存在显著性差异，但1.0 mg/L 2，4-D培养基中4个甘蔗品种均获得质量较好的胚性愈伤组织。

2.2 不同处理对云蔗03-258胚性愈伤组织的影响

2.2.1 对胚性愈伤组织诱导率的影响 在培养基中添加活性炭、PVP、Vc、脯氨酸以及采用液体培养方式进行甘蔗抗褐化实验，均能降低愈伤组织褐变。效果最好的是添加了活性炭的培养基B，其诱导率达到65.3%，+级的胚性愈伤组织达到83.5%；添加PVP的培养基C诱导率为62.5%，+级的胚性愈伤组织达到82.1%。

表3结果表明：培养基中添加活性炭和PVP对云蔗03-258胚性愈伤组织诱导率效果显著高于其它培养基，培养基添加Vc、脯氨酸和液体培养方式对胚性愈伤组织诱导率效果显著高于不添加抗褐化剂的培养基；而培养基中添加Vc、脯氨酸和液体培养方式对云蔗03-258愈伤组织诱导率效果差异不显著。

2.2.2 对胚性愈伤组织质量诱导的影响 经双因素方差分析表明：培养基中添加活性炭和PVP对云蔗03-258愈伤组织质量诱导的影响效果极显著高于其它4种培养方式；培养基添加脯氨酸和液体培养方式显著高于在培养基中添加Vc和无添加培养基。

综上所述：在培养基中添加活性炭和PVP对减轻外植体的褐变较为有效。

表3 不同处理胚性愈伤组织诱导率

3 结论与讨论

为了加快甘蔗新品种的推广和应用，对甘蔗新品种做高效的组织培养方法是很有必要的。生长素类似物2，4-D在不同浓度下对甘蔗胚性愈伤组织的诱导效果有明显差异，在浓度适合的条件下，甘蔗胚性愈伤组织生长良好。不同基因型甘蔗品种对2，4-D浓度的要求均不同，因此在大量繁殖过程中，应针对品种筛选出适宜的2，4-D浓度。在获得相近的诱导效果时，以低浓度为好，这样可以减少变异的发生。实验结果表明：云蔗06-407宜采用1.5mg/L 2，4-D，云蔗03-194、云蔗03-258及云蔗05-51则适宜采用1.0mg/L 2，4-D。

云蔗03-258褐变比较严重，最高诱导率只达到29.1%，+级的胚性愈伤组织诱导率只有52.9%。试验结果表明，添加活性炭2g/L或1mg/L PVP可以有效地提高云蔗03-258的愈伤诱导率。

在甘蔗组培苗生产过程中，大多要向培养基中添加抗褐化剂，而以PVP和活性炭使用最多，效果也较好。这两种试剂成本低廉，方便操作，适用于工厂化育苗。

[1]轻工业部甘蔗糖业科学研究所，广东省农业科学院.中国甘蔗栽培学[M].北京：农业出版社，1985.

[2]覃蔚谦.甘蔗高产栽培技术[M].南宁：广西科学技术出版社，1998.

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