奶牛隐性乳房炎大肠杆菌的鉴定与药敏试验

2013-08-30罗志尧陈天来

江西畜牧兽医杂志 2013年4期

罗志尧，陈天来

（1.兴宁市叶塘镇畜牧兽医站，广东梅州 514528；2.广东省兴宁市动物卫生监督所）

奶牛隐性乳房炎是微生物感染后或理化刺激引起的一种隐性的乳腺炎症，如果不及时发现和治疗，将很快发展成临床型乳房炎，是造成奶牛损失最严重的疾病之一。全世界2.2亿头奶牛中约有1/3的奶牛患各种类型的乳房炎，而隐性乳房炎约占奶牛乳房炎总数的1/2，不仅严重影响产奶量（可降低产奶量10%～15%）[1]，而且影响乳的品质，以至危及人的健康。引起奶牛隐性乳房炎的主要原因是感染病原微生物，包括多种细菌、真菌、病毒、霉形体等，其中以金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌为主，这三种菌引起的隐性乳房炎占隐性乳房炎总数的90%以上[2]。但是各地奶牛隐性乳房炎的病原感染情

况不尽相同，因地理环境、卫生条件、饲养方式和气候条件不同而有差异[3～5]。根据近几年文献统计数据显示大肠杆菌引起的奶牛隐性乳房炎正在迅速增加，现已占隐性乳房炎总数的47%以上。目前，国内外仍主要采用抗生素疗法，但由于抗生素的大量使用及滥用，导致细菌耐药性增强而降低了疗效，而且使奶中抗生素的残留量增加，危及人类健康[6，7]。为此，对广东省梅州市5个奶牛场2052头奶牛的奶样进行了随机抽样检测，并对隐性乳房炎进行了大肠杆菌分离、鉴定和药敏试验，对于筛选敏感药物、预防和治疗各类型乳房炎具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试剂与药品

1.1.1 培养基。普通营养琼脂培养基、麦康凯培养基、普通肉汤培养基、葡萄糖蛋白胨培养基、蛋白胨培养基、枸橼酸盐琼脂培养基、吲哚试剂、Barritt 氏V.P 试剂、革兰氏染液、美兰染液。

1.1.2 药敏纸片。（见表1）

表1 药敏纸片及生产厂家

1.1.3 隐性乳房炎诊断液。诊断液为加州隐性乳房炎诊断液（CMT 诊断液，中国农科院中兽医研究所药厂）。

1.1.4 试验取样牛场。（见表2）

表2 试验取样牛场的养殖数量

1.2 实验方法

1.2.1 隐性乳房炎的检测（CMT 实验）。按照说明书操作。

1.2.2 奶样采集。将CMT 检测阳性牛进行无菌采样。采样前用温水清洗乳房，擦干后先用碘酊消毒，再用75%酒精进行脱碘，挤去头2～3 把奶后，每个乳区采集奶样约5mL 于灭菌的青霉素小瓶内，贴好标签，4℃保存，6h内送实验室进行大肠杆菌分离。

1.2.3 大肠杆菌的分离。用灭菌棉签取隐性乳房炎阳性乳样接种于普通营养琼脂平板上，置37℃恒温培养箱中培养18～24h 后，挑取平板上形态不同的菌落分别进行美兰染色，100倍镜检，区别出杆菌和球菌，再用接种环挑取杆菌菌落划线接种于麦康凯培养基上，置37℃温箱中培养18～24h 后，挑取3～5个符合大肠杆菌生长特性（粉红色的菌落）的菌落，分别经营养肉汤增菌培养后，革兰氏染色、100倍镜检，符合大肠杆菌形态特征的菌经纯化后接种于营养琼脂斜面，培养18～24h 后，放置4℃冰箱保存。

1.2.4 生化鉴定

1.2.4.1 甲基红（M.R）试验。将分离所得菌株接种于装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管中，置37℃恒温箱培养48～72h 后。取出，沿管壁加入M.R.试剂5 滴，观察是否变色。若培养液由原来的橘黄色变为红色判为阳性。

1.2.4.2 乙酰甲基甲醇（V.P）试验。将菌株接种于葡萄糖蛋白胨培养液的试管中，置37℃恒温箱培养48～72h。无菌吸出培养物1mL 置另一试管，先加入0.6mL 5%的α－萘酚溶液，再迅速加入40%的KOH溶液0.2mL，用力振荡后，放37℃恒温箱保温10～15 min。培养液出现红色判为V.P 阳性。

1.2.4.3 吲哚试验。将菌株接种于蛋白胨培养基中，放置37℃恒温箱内培养24～48h 后，沿管壁慢慢加入吲哚试剂10～15 滴。如有吲哚存在，在试剂和培养基界面层呈现玫瑰红色判为阳性。

1.2.4.4 枸橼酸盐利用试验。在枸橼酸盐培养基斜面上划单线接种被检细菌，37℃培养48～72h。阳性者斜面有细菌生长，培养基变蓝色判为阳性。

1.2.4.5 药物敏感性检测。在已做过生化鉴定的大肠杆菌中，按不同牛场和不同乳区分别选取32株大肠杆菌作为药物敏感性检测的菌株。将待测菌株接种于普通肉汤培养基，置37℃恒温箱中培养18～24 h，取培养液5mL 加入到带刻度的离心管中，2 000 r/mim 离心20min，弃去上清，在离心管中加与沉淀物等量的生理盐水混匀，用细菌平板计数法，确定出cfu（每毫升培养液中细菌的数量）；用灭菌生理盐水将培养物稀释至1×109cfu。用灭菌棉拭子醮取菌液，均匀涂布于普通营养琼脂平板，用无菌镊子将药敏纸片均匀等距离平贴于培养板，每个平板上6 片。置37℃恒温培养箱培养，18h 后测量不同药敏片抑菌环直径，按照药敏纸片说明进行细菌药物敏感程度判定。

2 结果与分析

2.1 隐性乳房炎检测及其奶样中大肠杆菌分离率

在广东省梅州市5个奶牛场的518份有效奶样中，隐性乳房炎阳性率和大肠杆菌分离率有差异，见表3。

表3 隐性乳房炎检测结果及奶样中大肠杆菌分离率 %

由表3可知，隐性乳房炎平均头阳性率和乳区阳性率分别为56.94%和28.30%；大肠杆菌的平均头分离率和乳区分离率分别为29.83%和10.92%。将这几个月的奶样相比较，可得出，随气温的逐渐升高大肠杆菌所引起的隐性乳房炎在隐性乳房炎中所占比例逐渐升高，但是隐性乳房炎的检测阳性率则无明显变化。

2.2 分离菌株生化鉴定结果

在518份奶样中共分离出疑似大肠杆菌188株，对其中86株进行了5 项生化反应的测定，完全符合埃希氏大肠杆菌生化特性的菌株50株，占被鉴定菌株的58.14%，鉴定菌株5 项生化反应结果见表4。

表4 生化鉴定结果

2.3 奶中大肠杆菌对药物的敏感性

随机挑取完全符合大肠杆菌生化特性的32株菌进行临床常用治疗药物的敏感性检测，这些菌株对不同药物的敏感性见表5。

表5 大肠杆菌药物敏感性试验结果 %

由表5可知，所有菌株对头孢噻呋、多粘菌素和阿米卡星都高度敏感；部分菌株对多西环素、氧氟沙星和环丙沙星有一定耐药性；大部分菌株对阿莫西林、氨苄青霉素、链霉素和复方新诺明有很强的耐药性。

2.4 不同牛场奶样中大肠杆菌的药物敏感性

挑取完全符合大肠杆菌生化特性的不同牛场的3 2株菌进行临床常用治疗药物的敏感性检测，判定不同牛场的大肠杆菌药物敏感性见表6。

表6 不同牛场大肠杆菌的药物敏感性 %

由表6可知，尽管所有菌株对头孢噻呋、多粘菌素和阿米卡星的敏感度高，但是不同牛场菌株对不同药物的敏感性不同：牛场2 对头孢噻呋中度敏感；牛场4 对多粘菌素中度敏感，但是对氧氟沙星敏感；牛场3 除对头孢噻呋、多粘菌素和阿米卡星敏感外，还对环丙沙星敏感；且复方新诺明在牛场2、牛场3、牛场4、牛场5 都耐药，但在牛场1 中度敏感。