鸭源呼肠孤病毒Sigma A蛋白的原核表达及免疫活性检测

朱英奇，陈宗艳，李传峰，孟春春，王桂军，刘光清*

（1.安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥 230036；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

2011年上半年，中国太湖流域的许多养鸭场陆续发生一种新的鸭病毒性传染病，临床主要表现为发病雏鸭软脚，排白色稀粪，生长发育迟缓，发病率约为20%～60%，病死率在80%以上，给养鸭业造成了较为严重的经济损失[1]。经鉴定造成该次疫情的病原是一种不同于番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus,MDRV）的新型呼肠孤病毒（Duck reovirus，DRV）[2]。

与禽源呼肠孤病毒（Avian reovirus，ARV）相似，该病毒基因组由分节段的10个基因片段组成。其核酸SDS-PAGE电泳图式与ARV相似，与MDRV差异较大；但中片段、小片段迁移率与ARV和MDRV均有较大差异[3]。病毒编码10个蛋白，包括构成衣壳结构的8个结构蛋白和2个非结构蛋白。其中，Sigma A蛋白由S2基因编码，含有417个氨基酸残基，分子量为46.2 ku，是够成内衣壳的主要成分[4]。Sigma A蛋白具有结合dsRNA的功能[5]，Martnez-Costas等认为其通过阻断宿主细胞内病毒dsRNA依赖性蛋白激酶（PKR）的激活，从而阻断干扰素的抗病毒效应[6]。目前对呼肠孤病毒S节段编码蛋白的研究主要集中于Sigma B和Sigma C蛋白，Sigma A蛋白的功能有待进一步研究。

本研究对DRV的Sigma A基因进行了克隆和分析，并将其进行原核表达，为进一步研究Sigma A蛋白功能等奠定基础。

1 材料和方法

1.1 病毒株、菌株、载体及实验动物 大肠杆菌DH5α、原核表达载体pET-32a（+）由本实验室保存；大肠杆菌BL21（DE3）购自天根生化科技（北京）有限公司；4月龄雌性新西兰白兔购自上海斯莱克实验动物有限公司。

1.2 主要试剂 TRIzol RNA提取试剂购自Invitrogen公司；M-MLV反转录酶、ExTaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶均购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自生工生物工程（上海）有限公司；His-Tagged Protein Purification Kit购自北京康为世纪生物科技有限公司；HRP标记的羊抗兔IgG（HRP-IgG）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗DRV全病毒血清由本实验室制备保存；弗氏佐剂购自Sigma公司。

1.3 引物设计与合成 根据DRV S2基因序列（GQ664689）设计一对扩增Sigma A完整ORF的特异性引物，SigmaA-F：5'-ACTACGAATTCATGGCGCG TGCCGTGTAC-3'（EcoRⅠ）；SigmaA-R：5'-CCGAC TCGAGTTAGACGGTAAAGTG-3'（XhoⅠ）。预期扩增片段为1 251 bp，引物由上海杰李生物技术有限公司合成。

1.4 目的基因的扩增与克隆 参考文献[7]的方法提取DRV TH-11株病毒基因组，RT-PCR扩增SigmaA ORF片段，PCR扩增条件为：94℃5 min；94℃45 s、58℃45 s、72℃1m in 30 s，30个循环；72℃10 Min。产物经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后克隆至原核表达载体pET-32a（+）中，构建的重组表达质粒pET-SigmaA由上海杰李生物技术有限公司测序。

1.5 重组蛋白的诱导表达 将pET-SigmaA转化宿主菌BL21（DE3）中，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG进行诱导表达，并分别在诱导前及诱导后第2 h、4 h、6 h取出1m L菌液进行SDS-PAGE，以确定最佳诱导时间。超声破碎诱导6 h后的菌体细胞，进行SDS-PAGE分析Sigma A蛋白的表达。

1.6 重组蛋白的纯化及反应原性检测 采用镍离子亲和纯化柱进行纯化。以纯化的Sigma A重组蛋白为抗原，兔抗DRV TH11全病毒血清为一抗，以羊抗兔HRP-IgG为二抗进行western blot分析，检测Sigma A蛋白的反应原性。

1.7 多克隆抗体的制备及其效价测定 将纯化蛋白免疫新西兰白兔，初次免疫后每间隔两周进行1次免疫，共3次。第4次免疫一周后采血，用全病毒作为包被抗原建立的间接ELISA方法测抗体效价。

1.8 多克隆抗体间接免疫荧光（IFA）检测 将DRV接种于鸭胚成纤维细胞（DEF），培养2 d，加入4%多聚甲醛固定细胞，以制备的多克隆抗体为一抗，FITC标记的羊抗兔IgG为二抗，同时设未接种病毒的细胞为阴性对照，进行IFA鉴定。

2 结果与讨论

2.1 Sigm a A基因的克隆 用引物SigmaA-F和SigmaA-R扩增出DRV TH11株的Sigma A基因，其大小约为1 200 bp（图1），与预期结果相符。将纯化的PCR产物用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后，克隆于pET-32a（+）中，获得pET-SigmaA。该重组质粒经酶切与测序鉴定，表明获得DRV Sigma A基因。

2.2 Sigma A蛋白表达与纯化 将pET-SigmaA转化至BL21（DE3），用IPTG进行诱导，经优化，确定IPTG的最佳诱导浓度为0.5 mmol/L。用IPTG诱导6 h后，进行SDS-PAGE电泳。结果显示，重组Sigma A蛋白获得了表达，分子量大小约为66 ku（图2）。而且在菌体上清和包涵体中均有蛋白表达。用 6×His-Tagged Protein Purification Kit纯化重组蛋白，采用western blot进行鉴定，表明重组Sigma A蛋白可以与兔抗DRV阳性血清呈特异性反应（图2），证明纯化后的重组Sigma A蛋白具有良好反应原性。

图1 DRV Sigma A基因的RT-PCR扩增结果Fig.1 Amplification result of DRV Sigma A gene by RT-PCR

图2 SDS-PAGE（A）和western blot（B）鉴定、分析重组蛋白Fig.2 Identification of the recombinant protein bySDS-PAGE（A）and western blot（B）

2.3 多克隆抗体制备及其效价检测 以纯化的重组Sigma A蛋白免疫新西兰白兔，初次免疫后每间隔两周进行1次加强免疫，共3次。第四次免疫一周后采血，用间接ELISA测抗体效价，其效价在1∶20 000 以上。

2.4 多克隆抗体的IFA检测 DRV感染DEF细胞后，采用IFA检测到多克隆抗体与细胞中病毒Sigma A蛋白特异性结合，产生绿色荧光；而阴性对照组的细胞无荧光信号（图3）。

ARV Sigma A蛋白是主要内衣壳蛋白，具有阻断干扰素抗病毒的功能，在ARV的病毒粒子结构的稳定和致病机理上具有重要作用[8]。本研究采用RT-PCR技术扩增出了DRV-TH11株完整的Sigma A编码基因，将其插入原核表达载体pET-32a（+）中，在大肠杆菌种获得了高效表达，通过对诱导条件进行优化，表达的融合蛋白主要存在于上清中。重组蛋白经6×His-Tagged Protein Purification Kit纯化后经western blot检测表明重组蛋白具有良好的抗原性。以纯化的蛋白作为免疫原，制备了高效价、特异性结合的多克隆抗体。为今后进一步研究Sigma A蛋白功能以及检测方法等奠定了基础。

图3 多克隆抗体的IFA鉴定结果Fig.3 Detection of anti-SigmaA serum in DRV infected DEF cell by IFA

[1]Chen Zong-yan,Zhu Ying-qi,Li Chuang-feng,et al.Outbreak-associated Novel Duck reovirus,China,2011[J].Emerg Infect Dis,2012,18（7）:1209-1211.

[2]陈宗艳，朱英奇，王世传，等.一株鸭源呼肠孤病毒（TH11株）的分离与鉴定[J].中国动物传染病学报，2012，20（1）：10-15.

[3]陈少莺，陈仕龙，林锋强，等.新型鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定[J].病毒学报，2012，28（3）：224-230.

[4]Martnez-Costas J,Grande A,Varela R,et al.Protein architecture of avian reovirus S1133 and identification of the cell attachment protein[J].JVirol,1997,71（1）:59-64.

[5]Yin H S,Shien JH,Lee L H.Synthesis inEscherichia coliof avian reovirus core proteinσA and its dsRNA-binding activity[J].Virology,2000,266（1）:33-41.

[6]Martnez-Costas J,Gonzalez-Lopez C,Vakharia V N,et al.Possible involement of the double-stranded RNA-binding core proteinσA in the resistance of avian reovirus to interferon[J].J Virol,2000,74（3）:1124-1131.

[7]刘光清，倪征，张玉颖，等.兔病毒性出血症病毒JX/97株衣壳蛋白基因的序列测定与分析[J].农业生物技术学报，2006，14（2）：191-196.

[8]Xu W,Patrick MK,Hazelton P R,et al.Avian reovirus temperature-sensitive mutant tsA12 has a lesion in major core proteinσA and is defective in assembly[J].JVirol,2004,78（20）:11142-11151.