iTRAQ标记技术及其在微生物比较蛋白质组学中的研究进展

袁建丰，李林林，孙敏华，董嘉文，胡奇林

（1.广东省农业科学院兽医研究所，广东广州 510640；2.广东省兽医公共卫生公共实验室，广东广州 510640）

病原微生物的致病作用是由多种蛋白质共同参与下的病原微生物-宿主相互作用的复杂过程，因此应用比较蛋白质组学方法动态、整体和定量地分析病原微生物致病过程中蛋白质的差异表达谱，对于解析病原微生物的致病机制具有至关重要的作用。相对和绝对定量的等量异位标签技术（Isobaric tags for relativeand absolute quantitation，iTRAQ）以其高通量、重复性好、能够处理复杂样本和同时进行定性、定量分析的优点，在生命科学各个领域中得到了广泛的应用。

随着人类基因组计划的完成，生命科学进入后基因组时代，系统生物学迅速发展。蛋白质组学是系统生物学重要的技术平台，蛋白质组学以蛋白质组为研究对象，应用相关研究技术，从整体水平上认识蛋白质的存在及活动方式。它的真正意义在于：不是孤立地研究某种蛋白质分子的功能，而是研究某种蛋白质在复杂的细胞环境中的功能，从而能够揭示蛋白质的活动规律，透视生命的本质[1-3]。比较蛋白质组学着重于寻找和筛选两个或以上样本之间的差异蛋白质谱，揭示细胞生理和病理状态的进程与本质，同时获得对某些关键蛋白质的定性、定量和功能信息，在疾病的早期诊断、病程及环境因素影响分析等方面具有重要的应用价值[4-6]。它能够动态、整体和定量地研究病原微生物致病过程中蛋白质种类和数量的改变，并有助于深入研究病原微生物-宿主的相互作用[7-10]。

近年来，高通量蛋白质组学的仪器、试剂和技术的出现，使得同时识别和比较疾病发生以及与疾病治疗相关的蛋白表达水平变化成为可能[11]。iTRAQ技术是由美国应用生物系统公司ABI研发的一种多肽体外标记技术。该技术采用4种或8种同位素编码的标签，特异性标记多肽的氨基基团，然后进行串联质谱分析，可以同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量或绝对含量[12]。目前，iTRAQ标记技术已经在比较蛋白质组学研究中得到了广泛应用。本文就iTRAQ技术的原理、方法及在微生物比较蛋白质组学中的相关研究作一综述，以期为病原微生物蛋白质组学的研究提供参考和借鉴。

1 iTRAQ技术的主要原理

iTRAQ采用4种或8种同位素编码的标签，可以同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量或绝对含量。以8种不同的同位素试剂为例，这些试剂由3种不同的化学标签组成：标签分子分别由质量为113、114、115、116、117、118、119和 121的报道基团（Reporter group），质量为 192、191、190、189、188、187、186 和184的质量平衡基团以及一个相同的氨基酸特异性多肽反应基团（Amine specific peptide reactive group）组成。多肽反应基团将iTRAQ标签与肽段的N-端基团和每个赖氨酸侧链相连（因此可标记所有酶解肽段），8种报告基团通过质量平衡基团与多肽反应基团相连。由于iTRAQ试剂质量是等量的，即不同同位素在标记同一多肽后，在第一级质谱检测时分子量完全相同。用串联质谱方法对在第一级质谱检测到的前体离子（Precursor ion）进行碰撞诱导解离，产物离子通过第二级质谱进行分析。在二级质谱分析过程中，报告基团、质量平衡基团和多肽反应基团之间的键断裂，质量平衡基团丢失，产生低质荷比（m/z）的报告离子。由于二级质谱可以分析相对分子质量相差1的报告基团，不同报告基团离子强度的差异就代表了它所标记的多肽的相对丰度。同时，多肽内的酰胺键被断裂，形成一系列b离子和y离子，从而得到离子片段的质量数，通过数据库查询和比较，可以鉴定出相应的蛋白质前体。通过在样本中加入体外合成并且经一种iTRAQ标记的多肽标准品做内标，还可以进行蛋白质的绝对定量。

iTRAQ技术的一般操作流程[13]：样品先经胰蛋白酶裂解、烷基化、酶解为肽段，所产生的肽段用iTRAQ试剂多重标签进行差异标记，再将标记样本相混合，最后进行LC-MS/MS分析。每一个iTRAQ实验都会产生成千上万个光谱，数千个可识别多肽和上百个可鉴定蛋白，因此生物信息学工具和分析方法对于分析和解释这些数据是必不可少的。许多新近开发的数据管理和分析工具可以用来分析这些庞大的数据，如ProQuant、ProteinPilot等。

2 iTRAQ技术的优缺点

iTRAQ技术作为一种新的、能够进行绝对和相对定量的技术，具有良好的精确性和可重复性，弥补了传统技术的不足，其优点为：（1）可以同时对多种不同样本中的蛋白质进行定量比较，因此可以对正常与疾病、治疗前后、疾病发展过程、细胞培养的不同状态下蛋白质表达质和量的变化进行研究[2]；（2）由于iTRAQ试剂可以对每个蛋白的多个氨基及侧链氨基酸进行标记，因此几乎样本中的所有蛋白均可以标记，而且可以对膜蛋白、疏水蛋白等DIGE技术不能检测的蛋白进行标记[3]；（3）iTRAQ试剂可以标记修饰后的氨基酸，因此可以对磷酸化蛋白、糖基化蛋白等翻译后修饰（Posttranslational modifications，PTMs）蛋白进行定量和定性研究[6]；（4）iTRAQ试剂的报告离子为小分子物质，因此在质谱图中很容易与其它多肽片段离子区分，保证了定量的准确性[12-13]。目前，iTRAQ标记技术已成为研究蛋白质组学的有效工具。

和其它蛋白质组学研究技术一样，结合多维液相色谱和串联质谱的iTR AQ标记技术也有自己的局限性：对全蛋白质组而言，它只能对相对丰度进行比较，因此只能提供相对的定量；数据的复杂度更高，因此需要开发更多的信息学工具；高丰度蛋白质干扰了低丰度蛋白质的检测和鉴定；每次试验研究人员都必须鉴别全部的蛋白质组；i-TRAQ试剂几乎可以与样本中的所有蛋白结合，容易受样本中的杂质蛋白及样本处理过程中缓冲液的污染，需要对样本进行预处理并尽量减少操作过程中的污染；iTRAQ试剂仍非常昂贵，这也一定程度制约了它的广泛应用。

3 iTRAQ技术在微生物比较蛋白质组学研究中的应用

iTRAQ技术自2004年推出以来，已被广泛应用于生命科学的许多领域，包括标记蛋白质的发现、信号转导及翻译后修饰研究、时程变化分析、基因与蛋白质表达相关分析、细胞膜与亚细胞结构分析和药物靶点分析等。病原微生物的致病作用是多种蛋白质共同参与下的病原微生物-宿主相互作用的复杂过程，因此运用比较蛋白质组学方法动态、整体和定量地分析病原微生物致病过程中蛋白质的差异表达谱，对于解析病原微生物的致病机制，探讨病原微生物与宿主的互作，并从中寻找新的、潜在的药物靶标和疫苗靶分子具有至关重要的作用。

Ross等于2004年率先用iTRAQ-MS/MS技术比较了野生型啤酒酵母和两种基因缺陷型突变体的蛋白质组，证明该技术不仅可以提高蛋白质组表达差异分析的覆盖率，而且可以改善肽链断裂模式，在加入体外合成且经一种iTRAQ标记的多肽标准品后[14]，还可以进行蛋白质的定量。Aggarwal等采用iTRAQ-MS/MS方法研究rhsA元件表达存在不同的大肠杆菌蛋白质组的差异表达谱，找到了5 068个来自780种蛋白质表达有差异的多肽，其中包括一些转录因子等低丰度蛋白质，65%以上的蛋白质有2个以上的高可信度多肽与之匹配[15]。Li等用LC-MALDI MS Shotgun方法分析了白斑综合症病毒（WSSV）的蛋白质组，共鉴定出45个病毒蛋白，其中13个为首次报道，7个蛋白的N末端被乙酰化。在此基础上，作者利用iTRAQ技术鉴别病毒的包膜蛋白和核衣壳蛋白，共鉴定出23个包膜蛋白和6个核衣壳蛋白，从而表明iTRAQ技术能高通量地鉴别病毒蛋白质的分布[16]。Eshghi等利用定量蛋白质组学方法对问号钩端螺旋体Copenhageni血清型在体外传统培养条件和模拟体内培养条件（限制铁离子浓度和加入血清）下的总蛋白质组进行了比较分析，共鉴定出563个蛋白质，其中65个蛋白质呈差异表达，包括问号钩端螺旋体的毒力因子Loa22和5个新发现的、与其它病原菌毒力因子同源的蛋白质，从而提示我们比较分析模拟体内感染条件下蛋白质组的差异表达谱可以为鉴定病原菌新的、潜在的毒力因子提供一种快捷的、高通量的技术方法[17]。前期研究表明乙型肝病毒（HBV）能够调控肝脏血管生成（Angiogenesis），但其调控机制仍然未知。Zhang等将具有感染性的HBV病毒基因组转染于RPHs和HepG2细胞中，利用iTRAQ定量蛋白技术分析RPHs和HepG2细胞的差异蛋白质组，结果显示iTRAQ技术能够有效地评估肝脏血管生成中HBV病毒的复制，鉴定出的血管生成相关蛋白可以作为抗肝细胞癌治疗以及诊断方法的靶标分子[18]。早期诊断对于治疗HBV引起的急性肝病起着至关重要的作用，Feng等利用iTRAQ技术分析了前期实验中转染了HBV A/B/C基因组的HepG2细胞的分泌蛋白质组，结果表明共鉴定出32个特有的蛋白质，与空白组相比，大多数蛋白质呈下调表达[19]。Carranz等利用定量蛋白质组学方法，研究了苏黎世克洛诺斯氏菌（C.turicensis）对热应激和冷应激适应的分子机制，结果表明细菌在47℃生长时约有20%被鉴定的蛋白质表达水平发生了改变[20]。值得关注的是，在细菌热应激时许多毒力因子呈上调表达，从而提示细菌在该生长条件下具有潜在的致病性。Battchikova等应用鸟枪法蛋白质组学研究方法，分析了蓝细菌在低二氧化碳环境中蛋白质组的动态变化，结果表明19%的蛋白质表达水平发生了改变，占蓝细菌理论ORFs的17%，其中76个蛋白质呈明显的上调或下调表达[21]。为了研究卡泊芬净（Caspofungin）对烟曲霉（A.fumigatus）药物作用潜在的生物标记，Cagas等用iTRAQ技术比较了药物作用前后烟曲霉蛋白质表达谱的差异，结果显示在可溶性和细胞壁/细胞质膜的蛋白质中有471个蛋白呈特异性表达[22]。此外，总计有122个蛋白的差异表达水平至少超过2倍，其中线粒体缺氧反应蛋白的差异表达水平达16倍以上。Sivagnanam等通过iTRAQ，比较了以葡萄糖和木糖为不同发酵底物时丙酮丁醇梭杆菌（C.acetobutylicum）的蛋白质组，共鉴定出894个蛋白质，689个为两种底物所共有，22个蛋白质表现出明显的差异，结果显示以葡萄糖为发酵底物时鞭毛相关蛋白呈上调表达，而在以木糖为发酵底物时，由于CheW和CheV的缺乏，丙酮丁醇梭杆菌的趋化活性丧失[23]。伯氏疏螺旋体（B.burgdorferi）为引起莱姆病的病原体，研究表明伯氏疏螺旋体hrpA基因的缺失能够导致其侵染小鼠的能力完全丧失。Salman-Dilgimen等利用iTRAQ技术比较了hrpA基因野生型和突变型菌株的蛋白质组，共鉴定出187个差异表达蛋白质，结果提示hrpA基因可能是B.burgdorfer基因表达调控中的一种新的、远距离全局调控通路的一部分，并且首次报道了RNA螺旋酶是细菌基因表达全局调控途径中的调控元件，再次验证了RNAs参与细菌基因的表达调控这一最新观点[24]。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）优先感染肺泡巨噬细胞（PAMs）并且在其中复制，为了探寻感染病毒后PAMs细胞蛋白质组表达的差异，Lu等利用定量蛋白质组学方法分析了PRRSV感染和对照细胞之间蛋白质组的差异，结果表明差异蛋白主要与病毒结合、细胞结构、信号转导、细胞吸附等细胞功能相关，从而提示我们感染PRRSV的PAMs蛋白质表达谱有助于更深入地理解PRRSV的复制机制、致病机理以及与宿主细胞之间的相互作用[25]。

4 展 望

比较蛋白质组学是当今蛋白质组学研究的一个重要领域，比较不同生理和病理状态下细胞内蛋白质表达和蛋白质修饰，对于揭示生物系统复杂的生理和病理过程具有十分重要的意义。比较蛋白质组学着重于寻找和筛选两个或以上样本之间的差异蛋白质谱，揭示细胞生理和病理状态的进程与本质，同时获得对某些关键蛋白的定性、定量和功能信息。迄今为止，大多蛋白质组方法只能进行两个蛋白质样品的同步比较，如2-DE、DIGE等。目前只有iTRAQ技术能够同时进行8个样品的标记和同步比较分析。尽管iTRAQ技术还存在一些缺点和不足，但该技术在比较蛋白质组学中的应用价值已得到验证。可以预见，iTRAQ标记技术将会成为微生物比较蛋白质组学研究的主要技术手段，从而为解析病原微生物的致病机制，探讨病原微生物与宿主的互作，并从中寻找新的、潜在的药物靶标和疫苗靶分子作出积极的贡献。

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