疏肝和胃颗粒对反流性食管炎大鼠平滑肌细胞收缩和血浆胃泌素、胃动素等的影响

王学习， 路 莉， 李少海， 千维娜， 王 艳， 祁永福， 赵健雄

(1.兰州大学中西医结合研究所，甘肃兰州 730000;2.兰州大学药理研究所，甘肃省新药临床前研究重点实验室，甘肃兰州 730000)

胃食管反流病 (Gastroesophageal reflux disease)是一种复发频率很高的慢性难治性疾病，目前采用抑酸药物、促胃动力药物等对症治疗，短期疗效较好，但停药后易复发，长期用药患者依从性较差［1］。疏肝和胃颗粒 (汤)(专利号:200710017349.6)经临床验证，对反流性食管炎 (Reflux esophagitis)治疗已取得肯定的临床疗效［2］，动物实验表明，它可以降低反流性食管炎大鼠胃和食管pH值、改善食管炎性病理损伤、抑制黏膜增生［3］，其抗炎机制与调节人白介素23/人白介素17(IL-23/IL-17)炎症轴［4］和叉头样转录因子O4(FOXO4)信号通路［5］相关。为进一步探讨疏肝和胃颗粒对反流性食管炎大鼠的治疗作用及机制，进行其对胃平滑肌细胞收缩和胃肠激素水平影响的实验研究。

1 材料

1.1 试验药物 疏肝和胃颗粒(专利号:200710017349.6)处方组成及比例:柴胡10份、白芍15份、枳壳10份、姜半夏10份、陈皮10份、乌贼骨15份、黄芩10份、郁金10份、木香5份、生甘草5份，委托兰州佛慈制药厂加工生产，制备工艺为药材加8倍量水，浸泡1 h，提取3次，1 h/次，生产批号:09-05-10，临用前用生理盐水配制成含生药1.08 g/mL。

奥美拉唑胶囊，20mg/粒，鲁南贝特制药有限公司生产，国药准字H19990317。

1.2 动物 SPF级SD大鼠，雌雄各半，体质量 (220±20)g，由甘肃中医学院实验动物中心提供，动物许可证号:SCXK(甘)2004-2006-0000449。

1.3 试剂 Ⅱ型胶原酶、大豆胰蛋白酶抑制剂，Sigma公司;胃泌素 (GAS)、胃动素 (MTL)放免试剂盒，解放军总医院科技开发中心放免所提供;血管活性肠肽 (VIP)放免试剂盒，北京华英放免技术研究所。

1.4 仪器 JEM100B型透射电镜，美国BECTONDISCKINSON公司产品;CK—4032PH型倒置显微镜，日本OLYMPUS公司;全自动放免测定仪，中国科技大学中佳公司。

1.5 方法

1.5.1 造模 健康SD大鼠，适应性观察1周，行半幽门结扎联合贲门肌切开术复制反流性食管炎模型［3］。另取动物行假手术，即开腹后不进行任何手术操作关腹。所有动物禁食48 h，再行观察1周，剔除异常动物。

1.5.2 含药血清制备 取反流性食管炎模型大鼠分为模型组 (生理盐水)、奥美拉唑组 (奥美拉唑，8.7 mg/kg)和疏肝和胃颗粒组 (疏肝和胃颗粒，10.8 g/kg)，每组动物雌雄各半，所有动物等体积灌胃给药，每日2次，共3 d。于末次灌胃后2 h腹主动脉采血，分离血清，同组动物血清混合，0.22 μm微孔滤膜无菌过滤后，置－20℃冰箱保存备用。

1.5.3 食管、胃平滑肌细胞的制备及细胞收缩反应的测定 参考文献方法制备游离的大鼠食管［6］、胃平滑肌细胞。取造模成功1周未治疗反流性食管炎大鼠，实验前24 h禁食不禁水，剥取食管、全胃，HEPEs缓冲液中分别取食管下括约肌 (胃贲门与食管相连处呈壶腹状膨大且黏膜增厚、肌纤维呈环形排列的节段)、胃体 (距贲门约0.5 cm)、胃窦 (距幽门约0.5 cm)和幽门4个部分，剪成1～2 mm3的小肌块，31℃孵育消化2次，30 min/次，过滤，缓冲液洗。重悬肌块于HEPEs缓冲液中，31℃振荡30 min，500 μm尼龙网过滤，收集单个平滑肌细胞，调整细胞密度1×105/mL。台盼蓝检查细胞活性，实验要求成活细胞在90%以上。整个操作过程液体中均通O2。

取0.27 mL预热细胞悬液，接种于24孔培养板，加入0.09 mL含药血清，31℃孵育60 s，加入0.10 mL 2.5%戊二醛终止反应。每组设10复孔。每个样本倒置显微镜下随机测量20个细胞长轴作为该样本细胞长度。细胞的收缩反应是平滑肌细胞长度在加入药物或含药血清后出现缩小的现象，可以用缩小多少微米表示或者以给予药物或含药血清前后细胞缩小变化的百分数来表示。细胞收缩变化百分数=［(对照组细胞平均长度值－给药组细胞平均长度值)/对照组细胞平均长度值］×100%

1.5.4 动物实验分组与给药 造模动物随机分为模型组(生理盐水)、奥美拉唑组 (奥美拉唑，8.7 mg/kg)、疏肝和胃颗粒组 (疏肝和胃颗粒，10.8 g/kg)，假手术动物设为假手术对照组 (生理盐水)，另取正常动物作为正常对照组 (生理盐水)，每组10只。所有动物等体积灌胃给药，2 mL/200 g，1次/d，连续28 d。

1.5.5 标本采集 治疗结束后，动物腹主动脉取血，分装于2个一次性塑料试管内，一份标本2 mL用于分离血清，余注入含10%EDTA-Na2及抑肽酶的4℃预冷试管内分离血浆备用。取1 mL血浆加入4℃预冷丙酮2 mL，混匀，1 500×g低温离心15 min，取上清液，挥干丙酮后低温冷冻干燥，用于VIP检测。

采血后处死动物，剥取食管，肉眼大体观察黏膜损伤情况，后将食管分为2份，分别用4%甲醛和3%戊二醛固定。

1.5.6 大鼠食管黏膜组织病理学观察 取甲醛固定食管组织，常规切片HE染色，光镜下观察食管组织病理学改变，包括食管组织鳞状上皮增生和黏膜固有层中性粒细胞、淋巴细胞浸润情况等。

取戊二醛固定食管组织，制作切片，在电镜下观察细胞的超微结构，主要包括上皮细胞结构、胞质细胞器结构、细胞之间桥粒连接结构及细胞间隙等。

1.5.7 胃肠激素水平检测 取分离备用血清，放免法检测GAS水平;取分离备用血浆，放免法检测MTL;取经丙酮处理血浆冻干品放免法检测VIP检测。

2 结果

2.1 含药血清对胃食管平滑肌细胞收缩反应的影响 疏肝和胃颗粒含药血清孵育可以引起来源于食管下括约肌、胃体、胃窦和胃幽门部位平滑肌细胞收缩，引起平滑肌细胞长轴长度缩短，与正常对照组和奥美拉唑组比较，均有显著性差异 (P＜0.05/0.01)。奥美拉唑含药血清可引起食管下括约肌平滑肌细胞收缩，与正常对照组比较，有显著性差异 (P＜0.01);但其对胃体、胃窦和胃幽门部位平滑肌细胞收缩无影响，与正常对照组比较，无显著性差异(P＞0.05)。结果见表1。

表1 含药血清对食管和胃不同部位平滑肌细胞收缩变化的影响 (±s，n=10)

表1 含药血清对食管和胃不同部位平滑肌细胞收缩变化的影响 (±s，n=10)

注:与正常对照组比较，＊＊P＜0.01;与奥美拉唑组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

组别 剂量/(g·kg－1)收缩变化指数正常对照组 － 67.54±6.52 － 85.75±7.92 － 85.18±8.17 － 82.57食管下括约肌 胃体 胃窦 幽门细胞长轴长度/μm收缩变化指数细胞长轴长度/μm收缩变化指数细胞长轴长度/μm收缩变化指数细胞长轴长度/μm±8.99 －奥美拉唑组 0.008 7 58.91±6.11＊＊ 12.78 82.03±8.69 4.34 80.59±8.54 5.39 80.88±9.30 2.05疏肝和胃颗粒组 10.8 52.75±3.88＊＊▲ 21.90 69.05±6.66＊＊▲▲ 19.48 70.78±8.40＊＊▲ 16.90 70.07±8.67＊＊▲15.14

2.2 对反流性食管炎大鼠食管病理组织学的影响 大体观察可见，正常对照组和假手术组动物食管黏膜光滑完整，模型组大鼠食管黏膜均有呈点状或条索状等不同程度的发红，甚或出现糜烂、溃疡;奥美拉唑组、疏肝和胃颗粒组大鼠食管黏膜损伤程度介于上述二者之间。

光镜下可见，正常对照组和假手术组动物食管组织基本无炎性改变，上皮细胞层内间或存在少量炎细胞;模型组大鼠食管组织鳞状上皮增生，细胞层次增加，以基底细胞增生为主，黏膜固有层可见数量不等的中性粒细胞及淋巴细胞浸润;奥美拉唑组、疏肝和胃颗粒组食管组织炎性改变减轻，镜下可见鳞状上皮轻度增生，黏膜固有层可见少量的中性粒细胞及淋巴细胞。

电镜观察可见，正常对照组和假手术组动物可见正常食管黏膜上皮细胞，上皮细胞细胞器结构、上皮细胞之间间隙正常，细胞之间可见多个桥粒连接，未见桥粒连接及数量异常;模型组可见细胞之间间隙增宽，桥粒连接结构明显减少，胞质内细胞器肿胀;奥美拉唑组和疏肝和胃颗粒组上皮细胞及胞质细胞器结构、细胞之间桥粒连接和细胞间隙基本恢复正常。结果见图1。

图1 各组大鼠食管黏膜超微结构变化

2.3 对反流性食管炎大鼠血GAS、MTL和 VIP水平的影响 反流性食管炎大鼠模型血GAS水平下降，血MTL和VIP水平升高，与正常对照组比较，有显著性差异 (P＜0.05/0.01)。对照药物奥美拉唑可升高血GAS、MTL水平，降低血VIP水平，其中血GAS和VIP水平与模型组比较有显著性差异 (P＜0.01);血MTL水平与正常对照组比较具有显著性差异 (P＜0.01)，但与模型组比较无显著性差异(P＞0.0 5)，说明奥美拉唑不升高反流性食管炎大鼠血MTL水平。疏肝和胃颗粒可升高血GAS、MTL水平，降低血VIP水平，其中血GAS和VIP水平与模型组比较有显著性差异 (P＜0.01);血MTL水平与模型组和正常对照组比较均有显著性差异 (P＜0.05/0.01)。结果见表2。±s，n=10)

表2 对反流性食管炎大鼠血GAS、MTL和VIP水平的影响(

3 讨论

反流性食管炎属于祖国医学“泛酸”、“反胃”、“噎膈”等范畴，胃失和降，胃气上逆是本病的基本病机，肝胃郁热，酸水泛溢为本病的发病关键，治疗当以疏肝理气、和胃降逆、清泄热浊以治其本，制酸止痛以治其标。疏肝和胃颗粒方由柴胡、白芍、枳壳、姜半夏、陈皮、乌贼骨、黄芩、郁金、木香、生甘草十味药组成，方中四逆散疏肝理脾，半夏、陈皮和胃降逆，黄芩配半夏辛开苦降，木香、郁金行气活血，乌贼骨制酸敛疡，共奏疏肝理脾、制酸行气、和胃降逆之功。本实验结果显示疏肝和胃颗粒可改善反流性食管炎大鼠食管黏膜损伤，增加胃食管平滑肌细胞收缩力，调节血GAS、MTL和VIP水平。

反流性食管炎是酸相关性疾病，反流物进入食管，酸损伤引起食管黏膜炎症，超微结构表现为上皮细胞间隙增宽，并与食管酸反流的程度相关［7-10］。本实验结果显示疏肝和胃颗粒可以改善模型大鼠食管组织光镜下鳞状上皮增生、细胞层次增加及黏膜固有层中性粒细胞及淋巴细胞浸润等组织学损伤，恢复电镜下超微结构食管上皮细胞间隙增宽、桥粒连接结构减少及胞质内细胞器肿胀等组织学改变，上述改变与疏肝和胃降逆颗粒可减少食管反流物和食管酸损伤有关［11-12］。

反流性食管炎又是胃肠道动力相关性疾病。Biancani等［13］研究发现，长时间酸损伤可影响食管下括约肌的静息压力，从而减弱对酸性物质的清除能力。本研究行半幽门结扎联合贲门肌切开术复制反流性食管炎模型，引起大鼠食管胃内容物反流和胃排空延迟，导致反流性食管炎的发生。疏肝和胃颗粒含药血清孵育可引起食管下括约肌平滑肌细胞收缩增强，食管下括约肌的静息压升高，大鼠食管抗反流屏障功能改善，反流减少;同时，疏肝和胃颗粒含药血清亦可引起胃体、胃窦和胃幽门部位平滑肌细胞收缩增强，增加胃蠕动和排空能力，降低腹压，减少食管反流的发生。

反流性食管炎的发病机制与食管下括约肌功能异常密切相关，在反流性食管炎患者中表现为调节食管下括约肌张力和胃肠道运动的GAS、MTL和VIP等的异常。GAS是由胃窦及十二指肠黏膜开放型G细胞分泌，起到保护胃肠黏膜、增强胃肠黏膜保护因子和促进胃肠道的分泌功能，同时可提高幽门泵的活动，使幽门扩张，因而对胃排空有重要的促进作用［14］。MTL是由胃肠黏膜分泌的多肽，是公认的启动胃肠收缩活动的脑肠肽，对胃肠道自主运动和平滑肌肌电活动有兴奋作用，可提高胃肠道收缩力和张力，促进胃肠运动和胃排空，起着“清道夫”作用［15］。VIP为肠神经系统中的主要抑制性肽能神经递质，能引起食管下括约肌松弛，食管下括约肌压力与血浆中VIP含量呈负相关，VIP神经元增加或功能增强，可导食管下括约肌运动功能障碍。本实验结果显示，疏肝和胃颗粒可升高反流性食管炎大鼠血GAS、MTL水平，降低血VIP水平，促进胃肠平滑肌收缩，增加胃肠道的运动，这与本研究的离体实验疏肝和胃颗粒血清孵育可引起胃体、胃窦和胃幽门部位平滑肌细胞收缩的研究结论一致。

本实验结果中模型组大鼠血MTL水平与正常对照组比较未降低反而升高，可能与造模方法有关，研究采用半幽门结扎联合贲门肌切开术复制反流性食管炎大鼠模型，手术造成大鼠食管反流和胃排空延迟，并非原发性胃肠动力下降引起反流性食管炎。另外，奥美拉唑含药血清可引起食管下括约肌平滑肌细胞收缩，但对胃体、胃窦和胃幽门部位平滑肌细胞收缩基本无影响，其差异原因不明，尚待进一步研究。

上述实验结果提示，疏肝和胃颗粒可通过改善反流性食管炎食管黏膜损伤，增加食管、胃食管平滑肌细胞收缩力，调节GAS、MTL和VIP水平起到治疗反流性食管炎作用。

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